Dado que os cânceres de TEdeff são um obstáculo significativo contra a imunoterapia, nosso modelo farmacológico é uma ferramenta vantajosa porque imita adequadamente os defeitos transcricionais e epigenéticos generalizados observados em tais cânceres, e permite estudar essas anormalidades não genéticas para obter novas percepções, encontrar novos usos para drogas existentes ou encontrar novas estratégias contra tais cânceres. Trata-se de um modelo fácil de estabelecer e generalizável para estudar defeitos de alongamento transcricional em cânceres, permitindo estudar interações tumorais-imunes tanto in vitro quanto in vivo. Este método também pode ser aplicado às linhas de carcinoma humano.
Testamos isso em T47D e CAL51 para um curto prazo, dando origem a características semelhantes ao TEdeff. O protocolo que descrevemos aqui dá uma estrutura básica para minimizar as variáveis conhecidas críticas para a geração de recursos semelhantes a TEdeff pela inibição crônica do CDK9. No entanto, deve-se tomar cuidado para otimizar a dose subletal exata de flavopiridol para outras linhas murinas.
O impacto da variação na densidade do revestimento celular, condições culturais, condições de estimulação de citocinas pode variar para diferentes linhas de murina celular. Comece extraindo RNA poliA-positivo de metade das amostras anteriormente ribossômicas esgotadas de RNA usando contas magnéticas oligo dT. Resuspenja as contas no frasco vórtice por 30 segundos, e transfira 200 microliters das contas para um tubo.
Adicione um volume igual de buffer de ligação e misture o conteúdo. Coloque o tubo em um ímã por um minuto e descarte o supernasce. Em seguida, remova o tubo do ímã e resuspenja as contas lavadas em 100 microliters de tampão de ligação.
Ajuste o volume da amostra ribossômica esgotada de RNA para 100 microliters com Tris-HCl de 10 mililitros em pH 7.5. Adicione 100 microliters de tampão de ligação à amostra. Aqueça a mistura a 65 graus Celsius por dois minutos para interromper as estruturas secundárias de RNA e, em seguida, coloque-a imediatamente no gelo.
Adicione os 200 microliters de RNA total aos 100 microliters de contas lavadas e misture bem em um rotor por cinco minutos. Coloque o tubo sobre o ímã por um a dois minutos, remova cuidadosamente todos os supernasceres, depois remova o tubo do ímã e adicione 200 microliters de tampão de lavagem. Misture cuidadosamente a amostra por pipetar para cima e para baixo algumas vezes, devolva o tubo ao ímã por um minuto e remova o sobrenatante.
Em seguida, use um espectótmetro para medir a pureza e concentração do mRNA isolado ligado a contas. Use a metade restante da amostra ribossômica esgotada de RNA como entrada para proteína A colunas para imunoprecipitar RNAs tampadas cinco prime com anticorpo monoclonal 7-metilguanosine. Lave a proteína As contas magnéticas do kit RIP de acordo com o protocolo do fabricante para pré-ligar o anticorpo às contas, do anticorpo de 7-metilguanosina à conta suspensa em 100 microliters de tampão de lavagem do kit.
Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos enquanto gira em baixa velocidade. Em seguida, centrifugar os tubos brevemente, e colocá-los no separador magnético. Remova e descarte o supernascer, em seguida, retire os tubos do separador magnético, e resuspenque as contas com 500 microliters de tampão de lavagem.
Vórtice dos tubos, centrifuá-los brevemente, e colocá-los de volta no separador magnético, e novamente descartar o supernante. Em seguida, adicione 120 nanogramas de RNA ribossômico esgotado RNA às contas ligadas a anticorpos, juntamente com um microliter do inibidor RNase, e incubar a mistura à temperatura ambiente por 60 a 90 minutos com leve agitação. Após a incubação, gire a amostra a 300 vezes g por 10 segundos e transfira o supernante com o mRNA sem tampa para um novo tubo de microcentrifuge.
Repita a lavagem mais duas vezes com 100 microliters de tampão de lavagem e acumule o supernatante coletado. Elute o mRNA tampado das contas adicionando 300 microliters de tampão de ureia lysis preparados de acordo com as instruções do manuscrito e aquecendo a mistura a 65 graus Celsius por dois a três minutos. Combine 300 microliters da amostra elucidada com 300 microliters de fenol:clorofórmio:álcool isoamyl, inverta para misturar e deixe por 10 minutos.
Misture suavemente a amostra novamente e centrífuga por dois minutos. Pipete cuidadosamente a camada superior para um tubo fresco e descarte a camada inferior. Adicione 300 microliters de 2-propanol e 30 microlitres de acetato de sódio de três molares à amostra, inverta-o algumas vezes, e coloque-o em menos 20 graus Celsius por 20 horas.
Após a incubação, centrifufique a amostra por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte cuidadosamente o supernasce e seque a pelota à temperatura ambiente por cinco minutos. Resuspenque a pelota em água livre de nuclease, e meça a pureza e concentração do RNA com um espectotúmetro.
Isole células CD8 positivas de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, resuspende as células em tampão do sistema de separação magnética comercialmente disponível. Adicione 100 microliters de coquetel de anticorpos para cada mililitro de células, e incuba as células no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione 100 microliters de contas magnéticas por cada 100 microliters de coquetel de anticorpos, e deixe as células no gelo por mais 15 minutos.
Após a incubação, adicione sete mililitros de tampão de separação magnética às células, aliquot de três a quatro mililitros em um tubo fresco, e coloque o tubo em um magnético por cinco minutos. Decante o líquido com as células CD8 positivos para um tubo fresco no gelo. Em seguida, adicione os três a quatro mililitros restantes de células às contas magnéticas, e coloque o tubo no ímã por cinco minutos.
Decante o segundo lote de células CD8 positivas para o tubo com o primeiro lote. A semente projetou células de fibroblasto adeptos SAMBOK juntamente com a molécula co-estimulatória a 75.000 células por poço em placas de 24 poços, e cultuá-las em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, lave a monocamada APC uma vez com o meio modificado de Dulbecco de Iscove, e adicione 0,5 vezes 10 às seis células ingênuas em dois mililitros de médio suplementado de acordo com as instruções do manuscrito.
Cultue as células por 20 horas e, em seguida, colhe suavemente as células OT-I não aadesíveis coletando a mídia e pelotando as células a 191 vezes g por dois minutos. Conte as células e semee as células de um para um em uma co-cultura com B16/F10, células B16/F10-OVA não tratadas e células B16/F10-OVA pré-tratadas com flavopiridol. Cultue as células por 20 horas em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono, depois remova as células OT-I CD8 positivos e lave as células Aderentes B16/F10-OVA na PBS.
Trypsinize os três grupos de células anexadas em 05% EDTA com trippsina por cinco minutos, e depois pelota-as a 191 vezes g por cinco minutos. Incubar as células B16/F10-OVA colhidas em PBS frio com corante de viabilidade e anticorpos rotulados relevantes, em seguida, analisar a viabilidade com citometria de fluxo. Este protocolo tem sido usado para estabelecer um modelo de célula defeituoso de alongamento de transcrição que mostra uma perda profunda de fosforilação na posição serina 2 no domínio de repetição do terminal C da polimerase RNA II e uma diminuição significativa no H3K36me3, que está implicado na definição de limites exon e na inibição de transcrições enigmáticas fugitivas.
As células apresentam defeitos críticos de processamento de mRNA com proporções crescentes de mRNAs não-poliadenylated inadequadamente tampadas e não poliadenylated. Além disso, a repressão específica dos principais genes da via de resposta inflamatória e da morte celular mediada pelo FASL são observadas neste modelo celular. Um ensaio exploratório para testar se o modelo celular confere resistência ao ataque citotóxico de células T mostra que defeitos crônicos de alongamento de transcrição induzidos por flavopiridol podem conceder um meio de fuga de um ataque imunológico anti-tumor.
As células B16/F10 tratadas com flavopiridol, expressando o gene OVA, não eram suscetíveis às células T citotóxicas cd8 positivas, que têm uma toxicidade seletiva em relação às células que expressam OVA. As células não pré-tratadas com flavopiridol sofreram morte celular grave, enquanto os pais B16/F10 que não expressam o antígeno OVA sobreviveram. É importante lembrar que a redução do nível de trimetilação de fosforina 2 e H3K36 no tratamento flavopiridol de 25 nanomolars não garante uma redução tanto no nível fopsho-STAT1 quanto no nível fosfo-NF-kappaB.
Cada linha de carcinoma de rato é única, e JAK1 e CCNT1 podem resgatar o efeito do flavopiridol. Além disso, este modelo pode ser usado in vivo para monitorar a resistência oferecida pelos cânceres TEdeff contra respostas imunes anênais inatas e adaptáveis anti-tumor. Por exemplo, tratamentos anti-asialo poderiam ser usados para regular a atividade de células NK, e a terapia de checkpoint imunológico poderia ser administrada em camundongos portadores de tumores TEdeff.
O linfócito infiltrado em tumores, ou TIL, é um indicador de sucesso na imunoterapia. Nosso modelo abriu o caminho para explorarmos a extensão da ativação e exaustão das TILs no microambiente do câncer de TEdeff antes e depois da imunoterapia.
