Aqui, estabelecemos um sistema experimental simples que permite a reconstituição de complexos de alongamento Pol II ativos adequados para investigar o acoplamento funcional da transcrição Pol II e do capping de RNA. Com este método, os complexos de alongamento funcional podem ser facilmente montados com apenas alguns componentes. Os complexos de alongamento são imobilizados em contas magnéticas, por isso é fácil mudar as condições de reação.
Para imobilizar o oligo de DNA contendo biotina em contas magnéticas, primeiro adicione 200 microliters de contas magnéticas a um tubo de ligação de baixa proteína de 1,5 mililitro, e depois coloque o tubo em um rack magnético por dois minutos. Enquanto o tubo estiver no rack magnético, use uma pipeta para remover o líquido do tubo sem perturbar as contas. Para lavar as contas, remova o tubo do rack e adicione um mililitro de tampão de lavagem contendo Tris-cloridrato, EDTA e cloreto de sódio.
Devolva o tubo para o rack. Após dois minutos, remova a solução de lavagem e repita as lavagens mais duas vezes usando 200 microliters do mesmo buffer. Resuspenja as contas magnéticas em 400 microliters de tampão 2X.
Em seguida, adicione 380 microliters de água e 20 microliters de 10 micromolar não-modelo biotinínado DNA oligo para misturar. Coloque o tubo em um nutador e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, lave as contas com oligo de DNA não modelo imobilizado três vezes usando 200 microliters de buffer e, em seguida, três vezes com 200 microliters de armazenamento e tampão de diluição.
Armazene o tubo a quatro graus Celsius durante a noite para terminar de bloquear as contas com BSA. No dia seguinte, descarte a solução, resuspenja as contas em 200 microliters de armazenamento e tampão de diluição, para alcançar uma concentração aproximada de DNA de cinco micromolares, e, em seguida, transferir a solução com as contas para um novo tubo. Para obter o duplex DNA-RNA, prepare uma mistura de 10 microliteres em um tubo PCR com uma relação molar RNA-DNA de dois para um, como descrito no protocolo escrito.
Coloque o tubo em um cicloviário térmico. Defina o programa para 45 graus Celsius por cinco minutos, seguido por 12 ciclos de dois minutos cada, começando em 43 graus Celsius e diminuindo a temperatura em dois graus Celsius por ciclo. Por último, mantenha-o ocioso a quatro graus Celsius.
Para carregar a polimerase RNA purificada II no híbrido DNA-RNA, misture um microliter de DNA-RNA duplex com 13 microliters de tampão de polimerase II recém-preparado em um tubo. Adicione um microliter de polimerase RNA purificada II, e misture suavemente tubos para cima e para baixo e mexendo com a ponta da pipeta, sem introduzir bolhas. Incubar o tubo por 10 minutos a 30 graus Celsius.
Para completar o complexo de alongamento, adicione um microliter de contas oligo de DNA não-modelo imobilizadas a 14 microliters de tampão de DNA não-modelo, adicione a mistura de 15 microliteres ao tubo previamente incubado e incuba-o por mais 10 minutos a 37 graus Celsius. Coloque a amostra no rack magnético por dois minutos. Lave a amostra uma vez com 30 microliters de tampão de lavagem para remover polimerase II e oligos não incorporados.
Para radiolabelar os complexos de alongamento com RNA 23mers, adicione um microliter de ATP e um microliter de UTP radiolabeled a 23 microliters de tampão de pulso, e adicione essa mistura às contas magnéticas lavadas para resuspend. Incubar a reação por 10 minutos para permitir a síntese de 23mers radiolabeled. Adicione 1,5 microliters de solução contendo ATP de 100 micromolares e 100 micromolars UTP misture a 3,5 microliters de tampão de perseguição, e adicione a mistura ao tubo contendo complexos de alongamento pré-remontados em contas.
Novamente, incubar o tubo por cinco minutos para perseguir todas as transcrições nascentes em 23mers. Em seguida, coloque o tubo sobre o rack magnético, e lave como foi feito anteriormente para remover nucleotídeos não incorporados. Resuspenja a amostra em 30 microliters de tampão de lavagem.
Para gerar complexos de alongamento com transcrições mais longas, siga os procedimentos anteriores e aumente quatro vezes para gerar 120 microliters de complexos de alongamento lavados para quatro reações. Rotule três novos tubos 23mer, 25mer e 29mer. Transfira 30 microliters de complexos de alongamento lavados para o tubo de 23mer, e adicione 94 microliters de stop mix contendo proteinase K e glicogênio.
Coloque o tubo contendo os 90 microliters restantes de complexos de alongamento lavados no rack magnético por dois minutos, remova o supernascer e resuspende as contas em 90 microliters de BTB complementados com 1,2 microliters de ATP e CTP. Incubar por 10 minutos a 30 graus Celsius. Depois de lavar com 90 microliters de tampão de lavagem, transfira 30 microliters de complexos de alongamento para o tubo de 25mer, e adicione 94 microliters de stop mix contendo proteinase K e glicogênio.
Novamente, coloque o tubo contendo os 60 microliters restantes de complexos de alongamento no rack magnético por dois minutos. Repita o tratamento BTB com 60 microliters de tampão suplementados com 0,8 microliters de ATP e CTP. Após a incubação e lavagem como feito antes, resuspense a amostra em 60 microliters de tampão de lavagem.
Transfira 30 microliters da amostra para o tubo de 29mer, e adicione 94 microliters de stop mix contendo proteinase K e glicogênio. Analise produtos de reação em um gel de poliacrilamida de desnaturação. Primeiro, gerar complexos de alongamento lavados contendo 23mers, escalando 13 vezes o procedimento descrito anteriormente para obter 390 microliters para 12 reações e um extra.
Para realizar a fosforilação da CTD de polimerase II, remova o supernatante após colocar a amostra no rack magnético e resuspenja as contas em 377 microliters de BTB. Rotular dois novos tubos mais H e menos H.To mais H, adicionar três microliters do fator de iniciação de transcrição TFIIH na concentração de 300 nanogramas por microliter, e menos H, adicionar nove microliters de armazenamento e tampão de diluição. Adicione 87 microliters dos complexos de alongamento lavados ao tubo mais H e 261 microliters ao tubo menos H.
Incubar os tubos por 10 minutos e lavar com tampão de lavagem. Para realizar o capping de RNA, adicione 87 microliters de mistura de tampa ao tubo mais H e 261 microliters ao tubo menos H para resuspend. Rotule quatro novos tubos, cinco mais H, cinco menos H, 15 menos H, e 45 menos H, e distribua três microliters de cinco, 15 ou 45 nanogramas por enzima de tampa microliter nos tubos correspondentes.
Em seguida, prepare 12 novos tubos com 94 microliters de stop buffer. Inicie a primeira reação de capping adicionando 87 microliters de complexo de alongamento tratados com TFIIH ao tubo rotulado cinco mais H.Incubar a 30 graus Celsius em um bloco de calor. As reações de capping precisam ser precisamente cronometrdas usando um cronômetro.
Ao trabalhar com múltiplas reações, os tempos de início para cada reação devem ser escalonados. Após um, dois ou quatro minutos, transfira 30 microliters da mistura de cinco mais reação para tubos rotulados um, dois e três contendo 94 microliters de buffer stop para parar as reações. Proceda com reações de capping para as amostras nos tubos menos H restantes exatamente da mesma maneira, utilizando complexos de alongamento tratados sem TFIIH.
Analise produtos de reação em um gel de poliacrilamida de desnaturação. Um diagrama é mostrado aqui para moléculas de DNA e RNA em complexos de alongamento artificial. Utilizando o oligo RNA sintético de 20 nucleotídeos como primer de RNA durante a montagem dos complexos de alongamento artificial, nucleotídeos foram adicionados durante cada passo de caminhada sequencial do protocolo para gerar um 23mer, um 25mer e um 29mer.
Foram comparadas reações utilizando polimerase RNA II de diferentes fontes. Os complexos de alongamento artificial foram montados com polimerase i e endógena, tipo selvagem, purificados de fígado de rato ou levedura de fissão e caminharam para gerar 23mers ou 25mers. Um ensaio foi realizado para medir o capping de transcrições radiolabeled associadas a complexos de alongamento artificial contendo 23 transcrições de nucleotídeos com um final triphosfato de cinco primos.
As duas últimas pistas mostram os produtos das reações em que os complexos de alongamento foram incubados com ou sem enzima tampa na presença de TFIIH. As bandas mais lentas e mais rapidamente migratórias contêm transcrições tampadas e sem tampa, respectivamente. As primeiras 12 pistas mostram o capping de transcrições associadas a complexos de alongamento com um CTD fosforilado ou não fosforilado.
As atividades de polimerase II e outras enzimas podem variar de preparação para preparação, por isso é necessário otimizar as condições de reação, titulando concentrações enzimáticas para definir níveis ideais. É importante usar material radioativo com segurança e evitar contaminação. Por favor, certifique-se de seguir suas diretrizes de laboratório e instituto ao fazer experimentos com radioatividade.
