Seria bastante útil para traços de reprodução que são tecnicamente difíceis ou caros a serem determinados, como resistência a doenças, conteúdo mineral. É uma técnica simples, econômica e de alto rendimento. Para começar, coloque quatro discos de folha em cada poço de uma placa PCR de 96 poços.
Adicione 50 mililitros de tampão Uma solução em cada poço. Congele a placa em um congelador Celsius de menos 80 graus por 10 minutos. Em seguida, descongele a placa em temperatura ambiente.
Incubar a 95 graus Celsius por 10 minutos. Adicione 50 microliters de tampão B a cada poço, e misture bem por vórtice. Centrifugar a placa por um minuto a 1.500 vezes g.
Colete o supernatante como DNA para PCR. Primeiro, use o supernasal de DNA de um bem como modelo PCR para otimizar a temperatura de renas. Adicione reagentes e um microliter de DNA supernatante em cada poço PCR.
Coloque os tubos PCR em um bloco térmico com capacidade para gradientes e ajuste o programa de aquecimento de acordo com o manuscrito para determinar a temperatura ideal de ressarcimento de cada fragmento alvo. Realize a eletroforese para o produto PCR em géis de 1%agarose para examinar amplicons. Determine a temperatura de ressarcial ideal que permite a amplificação específica do fragmento de destino.
Para realizar a análise de HRM, combine reagentes, incluindo um microliter de 10 vezes corante de fluorescência e um microliter do supernatante de DNA em cada poço de placas compatíveis com HRM. Em cada placa, inclua uma amostra de pais do tipo selvagem e um controle negativo sem DNA. Adicione uma gota de óleo mineral a cada poço para evitar a evaporação.
Em seguida, sele a placa com filme adesivo, e centrífuga a 1.000 vezes g por um minuto. Execute o PCR usando a temperatura de ressarcial otimizada. Agora, remova o filme adesivo da placa e insira a placa em uma máquina HRM.
No software, selecione New Run no menu de arquivos ou pressione o botão Executar na parte superior da tela. Especifique as temperaturas de partida e término para o derretimento de 55 a 95 graus Celsius. Selecione amostras para análise de fusão de alta resolução e exclua amostras semelhantes ao controle negativo.
Normalize as curvas de fusão para ter o mesmo começo e fim da fluorescência. Confirme visualmente que os cursores de temperatura máxima mínimo e mais baixo estão em uma região das curvas. Mantenha o delta F, diferença de fluorescência, nível na configuração padrão de 05.
Na lista de seleção Padrões, selecione a variante comum versus e escolha a sensibilidade normal. Selecione H12 para usar o tipo selvagem como controle. Amostras com valor delta F maior que 05 são consideradas para conter plantas mutantes.
Em seguida, usando um método CTAB, extraia DNA de cada uma das quatro plantas da piscina mutante com a curva de fusão significativamente diferente do tipo selvagem. Após quantificação usando um espectótmetro, ajuste o DNA com o NanoDrop 2000 para uma concentração final de aproximadamente 25 nanogramas por microliter. Adicione 0,4 microlitros de primers PCR na amostra de DNA nos tubos PCR, coloque-os em um cicloviário térmico e ajuste o programa para amplificar o fragmento de destino.
Em seguida, envie os produtos PCR para uma empresa para sequenciamento. Após o sequenciamento de Sanger, compare a lesão molecular comparando as sequências entre a planta M2 e o tipo selvagem. Neste estudo, a varredura e análise de hrm de mudas M2 para mutações em genes OsLCT1 ou SPDT mostrou que a maioria das amostras apresentava curvas de fusão não significativamente diferentes do tipo selvagem com delta F menor que 05.
Os mutantes mostraram curvas HRM significativamente diferentes com delta Fs maior que 05 a temperaturas de 90 a 92 graus Celsius e 81,5 a 83,5 graus Celsius, respectivamente. O tipo de mutação e a posição nos genes de 4.560 mudas M2 foram confirmados pelos cromatógrafos sequenciamento. Um sítio heterozigoso com uma mutação de G para A em 4, 304 pares de base de OsLCT1 foi identificado.
Uma única inserção de nucleotídeos A apareceu nos pares de base 4.240 de OsLCT1, e uma exclusão trinucleotida TTC foi observada na posição de 5.948 a 5.950 pares de base de SPDT. Eu otimizei o PCR antes da análise do HRM. O corante no gel é um pouco prejudicial.
Lembre-se de colocar luvas ao executar o gel.
