Os autores agradecem a Fundação Bill e Melinda Gates para seu apoio de desenvolvimento de tecnologia e treinamento.

Nota: Este protocolo inclui os volumes e as concentrações para placa de 96 poços, as tiras de 8 tubos e sistemas à base de capilares (volume de reacção de 10 ul); No entanto, RH pode também ser realizada em sistemas à base de placa de 384 poços com um volume de reacção de 5 ul por escamação todos os volumes correspondentemente. A gama de detecção para a maioria dos sistemas é de 10 pg a 10 ng de ADN molde. 1. Prepare Templates <ol><li> Plasmodium falciparum obter amostras directamente a partir de sangue obtido de doentes que participaram nos estudos local de campo e armazenado como sangue completo, os glóbulos vermelhos sedimentados, ou em papel de filtro. Nota: As amostras também podem ser a crescer in vitro adaptados-cultura; algumas cepas padrão de laboratório para análise pode ser encomendado a partir do Reagente Malaria Research and Reference Resource Center (MR4, amostras podem ser usado diretamente em glóbulos vermelhos peletizadas ou cultura, ou extraído de sangue total, glóbulos vermelhos, ou filtro de papel. </li><li> O DNA extraído a partir depapel de filtro ou cepas adaptadas à cultura Nota: HRM é sensível à concentração de sal; diferenças de concentração devido a métodos de extração de variáveis ​​podem afetar significativamente a temperaturas de fusão. Enquanto buffers finais específicos não são um fator significativo para o sucesso, utilizar uma eluição ou ressuspensão tampão norma comum (ou seja, água, 1x Te [&#39;baixo Te&#39; ou &#39;tampão suspensão DNA&#39;: 10 mM Tris-Cl, EDTA 0,10 mM] ou 1x TE [10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM]) para todas as amostras para evitar curvas de fusão anómalos ou inconsistentes. <ol><li> Preparar diluições modelo de 10 pg -10 ng por mL em padrão Te, TE, ou água para cada reacção de 10 ul. </li></ol></li><li> A amplificação directa a partir de células vermelhas do sangue peletizadas <ol><li> Determinar a parasitemia de glóbulos vermelhos usando microscopia-esfregaço fina Nota: Os métodos para determinar a parasitemia de glóbulos vermelhos infectados estão disponíveis a partir do Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Diluir parasitemias acima de 0,5% 1: 400 em PCR-grade água, TE, ou Te. Use 3 ul para cada reação 5- 10 ul. </li></ol></li><li> Controles Nota: GRH pode ser utilizado para verificação do gene para detectar variantes de sequência de uma população 12; no entanto, a genotipagem preciso exige normas seqüência de verificado para conter o SNP sendo interrogado. Construções de plasmídeo ou malária isolados com genótipos conhecidos podem ser utilizados. Para a maioria das aplicações, 3D7 (MR4 ARM-151) é utilizado como um controlo de tipo selvagem. Devido à variabilidade entre-run, sempre incluir controlos positivos e negativos. <ol><li> Os controlos positivos: Prepare 10 pg - 10 ng por 1 diluições ul de plasmídeo ou normas com genótipos SNP verificou-seqüência. </li><li> Controle negativo: Use PCR água grau como um controle sem modelo (NTC) para as reações de amplificação. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Amplificação por PCR <ol><li> Prepare a mistura reaccional <ol><li> Uma camada de óleo (Opcional) Mineral. Nota: Alguns sistemas de gestão de recursos humanos são plataformas de fusão autônomo e não tem uma tampa aquecida para impedir a condensação e evaporação do produto durante a amplificação. <ol><li> Adicionar óleo mineral leve 20 ul a cada poço de placa antes de carregar a mistura de reacção. </li></ol></li><li> Prepare 10x stocks de trabalho de todos os ensaios <ol><li> Consulte a Tabela 1 para concentrações recomendadas 10x banco de trabalho, bem como as concentrações finais para genotipagem HRM-based-sonda bloqueada. </li></ol></li><li> Prepare misturas reaccionais <ol><li> A cada poço na placa ou tubo, adicionar 1 ul de estoque de trabalho de 10x a frente e iniciadores e sondas, 4,0 inverter - 2,5x 2,0x GRH ou 5.0 ul de mistura mestre, 1 ul de molde, e água de grau de PCR para um volume total de reacção de 10 ul . </li></ol></li><li> Cubra as placas ou tubos <ol><li> Use óptico placa seals para a amplificação baseada na placa, bonés ópticos para sistemas baseados em fita de tubo e tampas de plástico para sistemas baseados em capilares. Seja cobertura certeza é completo e placas e tampas são completamente selado e protegido para evitar a evaporação durante a amplificação. </li></ol></li><li> Amostras de spin <ol><li> Placas de Spin 3 min a 1800 xg para remover as bolhas de ar e para separar as fases aquosas de óleo e se o óleo mineral é utilizado. </li></ol></li></ol></li><li> Protocolo de amplificação <ol><li> Colocar as placas ou tubos de reacção em termociclador. Executar protocolos padrão-sonda bloqueada ou Maab de amplificação (Tabelas 2 e 3, respectivamente). Note-se a diferença de temperatura de recozimento entre estes métodos. </li></ol></li></ol> Análise 3. HRM <ol><li> Fundição <ol><li> Após amplificação por PCR, proceder à análise derretendo. Para os sistemas de fusão autônomos que não têm built-in amplificação (ex., Sistemas de BIOFIRE Defesa LightScanner), remover placa amplificado a partir termociclador e colocar em instrumento de gestão de recursos humanos. A partir do interface de software do sistema, derreter a placa da 40 - 80 ° C para produzir ambas as sondas e das amplicon picos de fusão. Nota: Para salvar fusão e análise de tempo, a janela de fusão pode ser encurtado para cobrir faixas de temperatura para apenas sondar ou regiões amplicon de fusão. Após a fusão, as placas e os tubos podem ser re-fundida, se necessário, e armazenados a -20 ° C ou 4 ° C. Tubos de vidro loja só a 4 ° C para evitar tubos de rachar. </li></ol></li><li> Análise Melt <ol><li> Retirar amostras negativas <ol><li> Dentro do software de análise, retire do mais amostras de análise que não amplificam ou que têm picos de fusão irregulares. Nota: Depois de selecionar o modo de análise para um arquivo run indivíduo, o instrumento agrupa automaticamente as amostras positivas e negativas. Antes de genotipagem de cada subconjunto, o usuário pode alterar as chamadas manualmente. <ol><li> Partindo do derretimentocurva ou pico de fusão de exibição, clique com o botão direito sobre as curvas de ser retirados para selecioná-los. Depois de selecionar as amostras classificados incorretamente, vá para &quot;Nova chamada&quot;, selecione o grupo apropriado e clique em &quot;Aplicar Mudança&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normalizar <ol><li> A partir da derivada negativa de fluorescência normalizada em relação à temperatura (-dF / dT) (&quot;Curves diferença&quot;) vista, mover barras de normalização para cercar a sonda derreta região. Nota: A sonda derreter região é a temperatura mais baixa das duas regiões de fusão. As barras de normalização deve ser na base dos picos de fusão. </li></ol></li><li> Calcule grupos <ol><li> Após a normalização, selecione &quot;grupos Calcular &#39;para atribuir automaticamente amostras de grupos. Se necessário, as amostras-re atribuir manualmente para grupos específicos. Nota: Alguns softwares de análise tem limiares de alta sensibilidade que não podem ser alterados; Nestes casos, o Software pode atribuir amostras a diferentes grupos que visualmente pertencem a outro. </li></ol></li><li> Atribuir genótipos <ol><li> Atribuir genótipos para cada grupo com base em padrões (controles positivos). <ol><li> Depois que o usuário confirma que os grupos computados estão corretas (se não, que as mudanças corretas foram feitas sob a guia Agrupamento selecionando amostras mal classificados e selecionando o grupo desde o drop-box ao lado de &quot;New Call&quot;), selecione &quot;Editar nomes de grupo &quot;sob a guia&quot; Agrupamento &quot;. </li><li> Digite os genótipos dos padrões na caixa de cor correspondente (por exemplo, se 3D7 padrão tem um conhecido Um genótipo e está no grupo vermelho, o grupo vermelho tem o genótipo A). Pressione &quot;OK&quot; e salvar os resultados. </li></ol></li></ol></li><li> Resultados de exportação <ol><li> Genótipo exportação chama como uma planilha para análise posterior população da amostra. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Continous HRM é um passo a análise pós-PCR; por conseguinte, a amostra de ensaio e a configuração é similar com protocolos padrão de PCR, com a incorporação adicional de um corante fluorescente intercalante usado para controlar a transição da cadeia dupla de ADN de cadeia simples durante o passo de fusão de alta resolução. O fator mais importante para a análise HRM bem sucedida é um produto robusto PCR. Desenho do ensaio é a chave, e várias ferramentas otimizadas para o projeto ensaio HRM estão disponíveis comercialmente e em linha 13. Comprimentos AMPLICON de 80-150 pares de bases com acompanhamento ~ 20 pares de bases bloqueado sondas centradas sobre o SNP ou SNPs de trabalho melhor interesse para diferenciar SNPs, bem como haplótipos de múltiplos SNPs na região da sonda. As sondas podem ser bloqueadas utilizando uma 3 &#39;espaçador C3 ou um par incompatibilidade 2 de base na extremidade 3&#39;, o que impede a extensão durante a amplificação. As sondas podem ser concebidas para combinar com a cadeia de Watson Crick ou molde; a escolhadepende de testes empíricos para determinar qual projeto sonda produz picos de fusão aceitáveis. O excesso de avanço ou retrocesso iniciadores são utilizados para a produção de produto de amplificação de cadeia simples que hibrida com as sondas bloqueados. Se a sonda contém a sequência da cadeia para a frente, em seguida, o iniciador inverso é utilizado em excesso, normalmente numa proporção de 1: 5, e vice-versa para as sondas que correspondem a cadeia inversa. Da mesma forma, GRH funciona melhor com o produto de PCR suficientes e robusta. Reacção de PCR requer optimização de PCR e de gradiente de agarose ou géis de análise Bioanalyzer para determinar as temperaturas de recozimento óptimas. Concentração do molde pode ser aumentada usando métodos como a pré-amplificação, a amplificação multiplexada tendenciosa de todos os alvos utilizando baixa concentração do primário e o número de ciclos para aumentar a concentração de molde 13. Apenas um punhado de instrumentos são compatíveis com Maab. As propriedades térmicas dos tubos capilares de vidro usado iN estes sistemas facilitar este método. O pequeno diâmetro interior dos capilares bem como a rápida transferência de calor através do vidro proporcionam um controlo de temperatura mais severas do que utensílios de plástico de PCR padrão, que tem mais lentas taxas de transição entre o recozimento e de desnaturação ciclos devido às propriedades isolantes térmicas dos plásticos. Com este método, as sensibilidades de detecção pode ser reduzido de 2-5% a menos de 1% de um alelo mutante em uma mistura de tipo selvagem e alelos mutantes 10. HRM é uma ferramenta fácil, eficiente e econômica para genotipagem SNP em uma variedade de configurações e inúmeras aplicações, desde a vigilância das doenças infecciosas para a digitalização para as variantes do gene do cancro. Vários outros instrumentos, tais como o Roche Nano e sistemas LightCycler (480 e 96), bem como o de Eco em tempo real do sistema de PCR oferta GRH além de amplificação padrão, em tempo real, e a funcionalidade de número de cópias. Usando máquinas de maior rendimento, custa HRM barcoding less de US $ 0,50 por ensaio em nossas mãos, incluindo todos os reagentes e consumíveis. No contexto descrito aqui, os aplicativos baseados em campo permitir a vigilância da população em tempo real para mudanças associadas com os esforços de controle da malária, incluindo a redução da diversidade da população, a detecção de tipos de parasitas importados, e o aparecimento ea propagação de SNPs associados à droga sensibilidade reduzida. Refinamentos ao método oferecer sensibilidade adicional útil para informar o progresso da eliminação da malária e de erradicação.

Apesar do renovado interesse no controle da malária e da erradicação, a malária continua a ser um fardo em todo o mundo, com quase metade da população do mundo em risco de infecção e mais de 550.000 mortes por ano, especialmente crianças na África sub-saariana 1. Estes novos programas de controlo e erradicação têm sido apoiados pelo renascimento genômica, com grande número de parasitas da malária sequenciados e analisados ​​para mutações associadas a sensibilidade reduzida de drogas, aumento da virulência, e para as características da população 2,3. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) estão entre as variantes genéticas mais comumente identificados 4-7. Métodos de genotipagem SNP portáteis oferecem no local e vigilância da população em tempo real e monitoramento 8. Além fingerprinting parasitas individuais, o &quot;código de barras molecular&quot; também é usado para detectar deslocamentos temporais dramáticas na frequência do alelobem como variância tamanho e complexidade de infecção 9 população efetiva. Embora este conjunto de informativo SNPs é facilmente adaptado para muitas plataformas de genotipagem, de alta resolução fusão (HRM) análise é particularmente adequado para estudos, onde a operação e detecção de mutações novas a baixo custo sensível e simples em comparação com a sequência eo outro campo baseada em abordagens são atraentes em ambientes pobres em recursos. HRM começa com reacção em cadeia de polimerase padrão (PCR) que incorpora um corante fluorescente. Pós-PCR análise de fusão determina a temperatura de pico amplicon de fusão; uma única diferença de SNP num curto amplicão pode resultar em substancial pico de temperatura de fusão (Tm) diferenças. Vários refinamentos a este método oferece melhor resolução genotipagem para diferenciar SNPs incluindo SNPs classe IV (AT), e detectar menores alelos mutantes em amostras com vários alelos presentes (poliGinfecções enomic). Em primeiro lugar, os ensaios de incorporar sondas curtas centradas sobre a região do SNP, além de transmitir e iniciadores que estão presentes em diferentes concentrações reversa. Estas sondas não bloqueados são amplificados durante a PCR, mas ligam-se ao fio produzido em excesso devido a concentrações de iniciadores assimétricos que aumentam a produção do produto sonda-molde. Estes produtos de amplificação de cadeia dupla separados constituídos por sonda ligada ao excesso de fita molde são ~ 20-30 pb; seu comprimento diminuiu significativamente em comparação com todo o amplicon (80-150 bp) levam a diferenças muito maiores Tm associados com a base única ou múltipla sonda-modelo não corresponde 10. Em segundo lugar, o alelo mutante viés amplificação (Maab) reduz a temperatura de recozimento da reacção para a reacção de polarização no sentido de alelos mutantes presentes em baixas proporções em infecções polygenomic. A temperatura de recozimento é definida entre as Tms de perfeitamente compatíveis (tipo selvagem) e descasados ​​sonda (mutante)s. A esta temperatura, a ligação do alelo de tipo selvagem é bastante estável que é impedida a amplificação em comparação com o seu equivalente incompatibilidade, por conseguinte, induzam a amplificação para o alelo mutante, quando ambos estão presentes numa única amostra de 10. Com esses refinamentos GRH, esta tecnologia tem permitido o rastreamento de origens e identidade de parasitas associados com infecções epidêmicas na América do Sul 11 e detecção de novas mutações, a diferenciação de vários SNPs localizados imediatamente ao lado do outro em seqüência, e mutações presentes em menos de 1 % dos alelos em amostras polygenomic 10. Aumento da sensibilidade é particularmente importante nas regiões que se aproximam status de pré-eliminação e aqueles em risco para o surgimento de resistência aos medicamentos. A capacidade de identificar rapidamente e facilmente parasitas importados e SNPs associados à redução da sensibilidade no local informa os esforços de vigilância e programas de controle sobrea eficácia das suas implementações e identifica hotspots para o aumento dos esforços de erradicação da malária e de eliminação. Este protocolo descreve os métodos para a sonda-bloqueado à base e para um aumento da sensibilidade Maab GRH genotipagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Apesar de décadas de esforços de erradicação, a malária continua a ser um fardo global. Renovou o interesse recente na eliminação regional e erradicação global tem sido acompanhado pelo aumento da informação genômica sobre Plasmodium espécies de parasitas responsáveis ​​pela malária, incluindo características das populações geográficas, bem como variações associadas com sensibilidade reduzida às drogas anti-malária. Uma variação genética comum, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), oferece alvos atraentes para parasita genotipagem. Estes marcadores são úteis não só para o rastreamento de marcadores de resistência a drogas, mas também para rastrear populações de parasitas por meio de marcadores que não estão sob drogas ou outras pressões seletivas. Métodos de genotipagem SNP oferecer a capacidade de controlar a resistência aos medicamentos, bem como a impressão digital parasitas individuais para a vigilância da população, particularmente em resposta aos esforços de controlo da malária em regiões que se aproximam eliminatestado de iões. Enquanto SNPs informativos foram identificados que são agnósticos às tecnologias de genotipagem específicas, de alta resolução derretendo análise (HRM) é particularmente adequado estudos com base em campo para. Comparado com métodos padrão fluorescente-sonda baseada que requerem SNPs individuais numa única sonda marcada e oferecem sensibilidade na melhor das hipóteses 10% para detectar SNPs em amostras que contêm múltiplos genomas (polygenomic), GRH oferece uma sensibilidade 2-5%. Modificações GRH, tais como sondas bloqueados e concentração de iniciador, assimétricos, bem como a optimização de temperaturas de recozimento para a amplificação por PCR no sentido de polarização de amplificação do alelo menor, pode ainda aumentar a sensibilidade da ARH. Embora a melhoria da sensibilidade depende do ensaio específico, que têm aumentado as sensibilidades de detecção para menos de 1% do alelo menor. Em regiões que se aproximam de erradicação da malária, a detecção precoce de emergentes ou resistência aos medicamentos importados é essencial para a prompT resposta. Da mesma forma, a capacidade de detectar infecções polygenomic e diferenciar os tipos de parasitas importados a partir de reservatórios locais enigmáticas pode informar programas de controle. Este manuscrito descreve modificações a tecnologia de fusão de alta resolução, que aumentam ainda mais a sua sensibilidade para identificar as infecções polygenomic em amostras de doentes.

Os dados podem ser visualizados em várias formas diferentes, dependendo do software e instrumento de análise. Tipicamente, um gráfico da derivada negativa da fluorescência normalizada em relação à temperatura (-dF / dT) contra os resultados de temperatura é mais simples para a visualização de picos de fusão e determinação de genótipos. Uma janela de fusão completa (40 ° C-80 ° C) irá resultar em ambas as regiões amplicon e de fusão da sonda. A Figura 1 mostra um exemplo de picos de fusão normalizados para ambas as regiões. Definir a janela de análise para apenas os resultados da região sonda em clara diferenciação dos picos correspondentes a SNPs específicas (Figura 2). Análise baseada em Sonda mostra claramente a presença de ambos os alelos como picos individuais a temperaturas de fusão que correspondem a picos homozigóticos SNP (figura 3). A Figura 4 mostra que progressireduzindo vamente a temperatura de recozimento durante a amplificação resultados (Maab) num viés para o alelo mutante (pico do lado esquerdo) (Figura 4A), o que resulta em um aumento da sensibilidade para o alelo mutante de uma população de alelos mistos (Figura 4B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figura 1. Sonda amplicão de fusão e as regiões. Locando a derivada negativa da fluorescência normalizada em relação à temperatura sobre uma ampla janela de resultados de fusão em ambos sonda (temperatura mais baixa) e os picos de fusão amplicão que podem ser analisados. (Adaptado de Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. Sonda picos de fusão. Partidas Perfeito (geralmente do tipo selvagem alelos) resultar em picos de fusão mais elevados (vermelho), enquanto descasamentos SNP têm temperaturas de fusão mais baixas (cinza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figura 3. Polygenomic picos de fusão. Quando ambos os alelos estão presentes numa amostra, com base em análise de GRH sonda representa ambos os alelos como curvas de dois picos (laranja) com picos que correspondem a amostras de um único alelo (vermelhas e cinzentas). (Adaptado de Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma v maior</a>ersion desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figura 4. Mutante amplificação alelo polarização (Maab). A. Progressivamente a diminuição da temperatura de recozimento de amplificação faz o enviesamento do pico de fusão para o pico de reacção correspondente ao alelo mutante (temperatura mais baixa) numa amostra polygenomic ou polyallelic. B. Maab resulta em sensibilidade GRH para detectar alelos menores presente em menos do que 1% em amostras polygenomic ou polyallelic. (Parte B adaptado de Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Tabela 1. Set-up de alta resolução reacções de amplificação de fusão à base de sondagem. <table><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume por reação (placa de 96 poços e tubo capilar) </td><td> Volume por reacção (384 poços da placa) </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 ul </td><td> 2-2,5 ul </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x iniciador em excesso </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,50 mM </td></tr><tr><td> 10 x outro iniciador </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ï¿½ </td><td> 0,1 uM </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,40 mM </td></tr><tr><td> Água PCR-grade </td><td> 1-2 ul </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td></tr><tr><td> ADN molde </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,01-10 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 ul </td><td> 5 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Standard alta resolução condições de amplificação de fusão. <table><tbody><tr><td> Temperatura </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> Aguarde </td><td> 95 ° C </td><td> 120 seg </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 ciclos </td><td> 95 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 seg </td></tr></tbody></table> * Esta temperatura é dependente do amplicão Tabela 3. As condições de amplificação para amplificação de polarização alelo mutante. <table><tbody><tr><td> Temperatura </td><td> Tempo </td><td> Cycles </td><td> Taxa de rampa </td><td> Modo de aquisição </td><td> Modo de análise </td></tr><tr><td> Desnaturar </td><td> 95 ° C </td><td> 30 seg </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Nenhum </td&gt; <td> Nenhum </td></tr><tr><td rowspan="2"> Ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 2 seg </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Nenhum </td><td rowspan="2"> Quantificação </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 seg </td><td> 20 </td><td> Solteira </td></tr><tr><td rowspan="3"> Fundição </td><td> 40 ° C </td><td> 0 seg </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0,3 </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 seg </td><td rowspan="2"> Continous </td><td rowspan="2"> Fundição </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 seg </td></tr></tbody></table> * Esta temperatura é dependente do amplicon e será reduzido ao realizar Maab

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Enquanto a análise de alta resolução de fusão oferece a capacidade de diferenciar entre polimorfismos de nucleotídeo único em uma população heterogênea, viés amplificação alelo mutante pode aumentar a sua capacidade para detectar alelos presentes em percentagens relativamente baixas dentro de uma amostra. Este protocolo descreve melhorias que melhoram a sensibilidade da análise de fusão de alta resolução.

Métodos para aumentar a sensibilidade de alta resolução de derretimento Single Nucleotide Polymorphism Genotipagem em Malária

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K visualizações.  Harvard University.  Enquanto a análise de alta resolução de fusão oferece a capacidade de diferenciar entre polimorfismos de nucleotídeo único em uma população heterogênea, viés amplificação alelo mutante pode aumentar a sua capacidade para detectar alelos presentes em percentagens relativamente baixas dentro de uma amostra. Este protocolo descreve melhorias que melhoram a sensibilidade da análise de fusão de alta resolução. 

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Imunologia e Infecção

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Pintura de cromossomo 2D e 3D em mosquitos da malária

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Alta resolução de Microscopia Eletrônica da<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Um método rápido para processamento de sangue para aumentar o rendimento dos níveis plasmáticos de peptídeos no sangue humano

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...