Este protocolo permite que as sementes sejam fatiadas intactas para que não desmoronem, permitindo a visualização de grânulos de amido em qualquer semente que possa caber em uma ponta de pipeta. O cone plástico maleável suporta a estrutura nativa dos tecidos e órgãos secos, de modo que este coletor barato e fácil permite que muitas amostras sejam processadas em pouco tempo. Para continuar com a vantagem da microscopia forense aqui, amido resistente, algo que todos estamos procurando, acessibilidade de enzimas para esse amido cru, amilolise, índice glicêmico e picos de glicose, estes são parâmetros centrais para criar melhores variedades de arroz para combater o diabetes tipo 2 em todo o mundo hoje.
E agora é um grande prazer apresentar o Dr. Kiah Barton a você. Dr. Barton é do nosso laboratório e ela vai usar a instalação de imagens do núcleo da faculdade para mostrar como esta técnica é implantada. Comece desalvando os grãos secos.
Coloque um único kernel em uma rolha de borracha plana em um banco de trabalho, e certifique-se de que esta rolha permaneça estacionária. Use uma segunda rolha de borracha plana para abrasar o kernel torcendo-o contra a primeira rolha de borracha, em seguida, remova as cascas do kernel, tomando cuidado para não quebrar o endosperm nem moer as sementes muito agressivamente entre os dois bungs de borracha. Remova todas as cascas restantes usando fórceps finos e insira um kernel com casca individual em uma ponta de pipeta de 250 microliter de plástico.
Certifique-se de que a extremidade do embrião do kernel está voltada para a extremidade cônica da ponta da pipeta. Insira uma segunda ponta de pipeta de 250 microliter para forçar o kernel na primeira ponta de pipeta e mantenha o kernel imóvel durante a secção, tomando cuidado para não danificar o kernel ou dobrar a segunda ponta da pipeta. Coloque a montagem da ponta da pipeta plana em uma bancada e segure-a no lugar à mão.
Por outro lado, use uma lâmina de bisturi afiada para cortar o centro do kernel, cortando a ponta da pipeta. Corte para baixo através da montagem e, em seguida, oriente a lâmina do bisturi verticalmente para que as duas novas faces expostas da seção da mão sejam paralelas. Em seguida, use o bisturi para cortar seções de um milímetro de espessura do grão de arroz.
Para realizar microscopia leve refletida, coloque as seções de arroz transversais em um pedaço de papel preto de bitola pesada. Obtenha imagens leves das seções transversais usando um microscópio estéreo com pescoços de ganso montados para iluminação oblíqua, usando pelo menos 10 vezes a ampliação. As seções Nipponbare e SSG1 foram examinadas menos de 260 vezes, 920 vezes e 4.200 vezes ampliações.
Quando devidamente preparadas, as seções de arroz tinham aproximadamente 0,9 milímetros de espessura com quebra mínima do endosperma e camadas intactas de pericarp e aleurone. Esta técnica permite a preparação de seções de qualidade suficiente para observar toda a célula endosperm, grânulos compostos de amido e sub-grânulos individuais. Os produtores translúcidos de grãos, como a linha híbrida resistente ao amido selvagem, Zhehui 7954 e o mutante RS111 gerado por cobalto, produziram grânulos de amido poliédrico bem embalados, que é o fenótipo normal de endosperma de arroz.
As imagens SEM de produtores de grãos de giz, variedade comercial Ye Tang e RS4, exibiam grânulos de amido que eram redondos e vagamente embalados. Xiushiu 11 e seu mutante KMD1, que expressou o gene Cry1Ab para inibir a predação de insetos, tinham seções e morfotipos de endosperm semelhantes às linhas de amido resistentes translúcidos. Esta técnica pode ser aplicada às sementes de outras espécies.
O modelo monocote, Brachypodium distachyon, produz sementes muito duras, mas ainda era possível obter uma seção transversal intacta. Seções transversais intactas também foram produzidas a partir de trigo de inverno branco e macio. Este método de triagem rápido e barato para olhar dentro de estruturas biológicas pode ser aplicado a pernas de insetos, espinhos de árvores de lócus, espinheiros, espinhos de peixe ou qualquer campo de microscopia forense que possa lucrar com essa configuração de suporte amostral.
Após a realização deste protocolo, o revestimento de sputter para eletromicroscopia, a coloração com corantes fluorescentes específicos e a aplicação de calcafluor para colorir para uma espessura da parede celular glucana beta em linhas de aveia mutante e cevada são algumas maneiras rápidas de se aproximar da reprodução vegetal com triagem rápida de fenótipo.
