A geração de esferoides hepáticos humanos usando fontes autólogas pode contribuir para várias áreas de pesquisa, como toxicologia, câncer e descoberta de medicamentos. A principal vantagem desta técnica é usar hepatócitos humanos derivados de BDPC para projetar esferoides hepáticos humanos, contornando a escassez de hepatócitos humanos primários ou PHH. Os esferoides humanos autólogos podem ser estendidos à medicina regenerativa e terapia, especialmente em pacientes com insuficiência hepática aguda.
Demonstrando o procedimento estará a Dra. Anne-Katherin Schott, líder do projeto no meu laboratório. Comece por preparar 500 mililitros de hexablasto KnockOut sérum substituição dimetil sulfóxido ou KSR DMSO meio e meio de maturação de hepatócitos. Aliquotar o meio da unidade populacional e adicionar o fator de crescimento de hepatócitos frescos ou HGF e oncostatina M ou OCM em concentrações finais de 10 ou 20 nanogramas por mililitro para cada mudança de meio.
Transfira três vezes 10 para a quinta células-tronco pluripotentes derivadas do sangue ou células BD-PSCs para uma placa de quatro poços revestida de biolaminina e incube a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Para apoiar a diferenciação endodérmica, cultura das células por cinco dias em meio hepatoblástico KSR DMSO e troca do meio a cada 48 horas. No quinto dia, adicionar o meio de maturação dos hepatócitos e cultivar as células por mais sete a 10 dias na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, garantindo a troca do meio a cada 48 horas.
Contagem de células utilizando uma câmara de contagem e centrífuga de suspensão de células desdiferenciadas BD a 300 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do sobrenadante, ressuspender as células BD desdiferenciadas em meio KSR DMSO a duas vezes 10 das seis células por mililitro de concentração. Depois de garantir a suspensão de célula única, remova quaisquer detritos adicionais passando as células através de um filtro de células de 40 micrômetros.
Novamente, conte as células usando uma câmara de contagem e prepare um volume suficiente de cada densidade de semeadura celular para dispensar o volume necessário por poço. Prepare um gradiente com semeadura superior de um milhão de células para uma baixa densidade de semeadura de 4.000 células. Em seguida, dispense 100 microlitros de meio KSR DMSO em placas de fixação baixa de 96 poços e adicione 100 microlitros de diluição de semeadura celular.
Incube a placa de fixação baixa por cinco dias. Alterar 50% do meio no terceiro ou quarto dia após a semeadura, quando os esferoides estiverem suficientemente compactos. No quinto dia, mude o meio para o meio de maturação dos hepatócitos e faça a cultura das células nele por mais sete a 10 dias, alterando o meio a cada 48 horas.
Depois de cultivar as células por 4, 8, 15 e 24 dias usando o método de diferenciação descrito anteriormente, remova o meio. Incubar as células com fixadores pré-aquecidos contendo 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos. Em seguida, descarte o fixador e lave as células com PBS duas vezes por cinco minutos cada.
Adicionar imediatamente a solução de Triton X-100 a 0,1% e permeabilizar as células durante cinco minutos antes de duas lavagens de PBS. Adicionar uma solução de bloqueio feita de PBS e albumina sérica bovina a 5% ou BSA antes de colocar as células numa placa balancim durante uma hora à temperatura ambiente. Diluir os anticorpos primários em tampão de diluição 1%BSA PBS e adicionar 50 microlitros da diluição do anticorpo por poço.
Rejeitar a solução de anticorpos após uma incubação de uma hora à temperatura ambiente e administrar três lavagens de cinco minutos cada utilizando PBS. Adicionar 50 microlitros de anticorpos secundários diluídos em tampão de diluição em cada poço e incubar as células durante 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar as células três vezes com PBS por cinco minutos cada, monte as tampas com meios de montagem contendo DAPI para análise microscópica.
Descarte cuidadosamente os meios de cultura sem tocar nos esferoides e adicione PBS recém-preparado com solução de 0,1% de Triton X-100 e incube por cinco minutos para permeabilizar as células. Lave os esferoides duas vezes com o meio, pipetando lentamente o meio. Em seguida, incube os esferoides com 50 microlitros dos anticorpos primários por uma hora.
Uma vez feito, remova cuidadosamente o excesso de solução de anticorpos e dê três lavagens de meio. Prepare os anticorpos secundários correspondentes como IgG Cy3 anti-camundongo de cabra, IgG 488 anti-camundongo de cabra e IgG Texas Red anti-frango de coelho em PBS com 1% de BSA e adicione 50 microlitros de diluição de anticorpos por bem antes de 20 minutos de incubação na incubadora de dióxido de carbono. Novamente, lave três vezes com o meio antes de 30 minutos de incubação na incubadora.
Ligue a fonte de luz de fluorescência 10 minutos antes do uso. Ligue o computador e abra o software de geração de imagens. Use o objetivo de ampliação 4X clicando no botão 4X na barra de ferramentas para selecionar a barra de escala correta.
Em seguida, coloque a placa de 96 poços na placa central do palco. Ligue a fonte de luz LED, use o filtro de campo brilhante e posicione a placa no poço de interesse usando o botão de ajuste de estágio do eixo XY. Mude para o caminho da luz da câmera e clique no botão ao vivo no software de imagem para visualizar a imagem na tela.
Certifique-se de que o esferoide está centralizado usando os botões do eixo XY e foque usando o botão de foco grosso ou fino. Em seguida, escolha o método de observação de campo brilhante na barra de ferramentas, coloque as configurações de exposição como automáticas e clique no botão de instantâneo no painel de controle da câmera para tirar uma foto. Em seguida, salve a imagem como arquivo vsi usando o nome apropriado na pasta de interesse.
Coloque a placa de proteção da luz ambiente para desligar a luz LED e trocar o filtro para excitação B. Em seguida, escolha o método de observação 488. Abra o obturador, tire uma foto clicando no botão de instantâneo e feche o obturador e salve o arquivo como um vsi.
Repita o processo com um filtro para excitação G para reiterar o processo para cada poço de interesse. Alterações morfológicas durante o processo de diferenciação hepática mostraram que as BD-PSCs se diferenciaram em hepatócitos através de três estágios. O primeiro estágio representou a diferenciação em células endodérmicas.
A segunda diferenciação em células progenitoras hepáticas exibindo uma morfologia poligonal típica. E a terceira, a maturação para hepatócitos. A análise de imunofluorescência mostrou a forte expressão de marcadores progenitores hepáticos humanos endoderme como a alfa-fetoproteína ou APF e transtirretina ou TTR nas células no primeiro estágio do processo de diferenciação hepática no dia L4 a L8.
No entanto, sua expressão diminuiu no dia L15. A expressão de albumina ou ALB e do fator nuclear de hepatócitos quatro alfa ou HNF4 alfa apareceu primeiramente em L4, aumentou ao longo do tempo de diferenciação de L4 a L15 e atingiu uma expressão forte e estável durante o tempo de maturação de L15 a L24. A agregação espontânea de células foi observada em placas de baixa fixação contendo indução de hepatócitos ou formação esferoide iniciada por meio de maturação.
Uma correlação consistente foi observada entre o esferoide esteroide e a variável número de células. Os esferoides formados e diferenciados em L14 e vivos corados com anticorpos revelaram a potencial atividade funcional hepática dos esferoides derivados de BD-PSCs. A preparação de células mononucleares para reprogramação é o passo mais importante neste procedimento.
A geração de esferoides hepáticos humanos é o primeiro passo para a criação de organoides in vitro versão simplificada do órgão em 3D com microanatomia semelhante à in vivo. Organoides criados em laboratório são usados para estudar organogênese, desenvolvimento de doenças e nutrientes.
