Demonstramos como usar nosso software recém-desenvolvido, Auto-CHO, para síntese hierárquica de oligossacarídeo de um pote. O Auto-CHO inclui algoritmos em blocos de construção expandidos, com valores relativos de reatividade previstos através do aprendizado de máquina. O software Auto-CHO fornece uma diretriz valiosa para a seleção de blocos de construção e um projeto hierárquico para a síntese múltipla de um pote de glicocanos mais complexos através da composição de fragmentos.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia de cânceres ou doenças infecciosas por terapêuticas à base de carboidratos. Antes de usar o Auto-CHO, certifique-se de que o Ambiente Java Runtime tenha sido instalado em um PC ou Mac. A demonstração visual da manipulação do software Auto-CHO e o experimento de determinação de valor de reatividade relacionado ajudarão os químicos a seguir o protocolo e prosseguirão com o experimento rapidamente.
Para realizar a inicialização do software do Java Runtime Environment, acesse o site Auto-CHO e baixe o software de acordo com o sistema operacional. Atualmente, o Auto-CHO suporta Windows, macOS e Ubuntu. O mais recente guia de usuário PDF é fornecido no site auto-CHO.
Para usuários do Windows, descompacte o Auto-CHO Windows. zip, e clique duas vezes em Auto-CHO. frasco na pasta Windows Auto-CHO para iniciar o programa.
Insira a estrutura glican desejada. Escolha desenhar uma estrutura glican ou ler um arquivo de estrutura existente. Para inserir por desenho, clique em editar glycan por GlycanBuilder ou na área de clique aqui para editar o alvo sintético para desenhar e editar a estrutura de consulta pelo GlycanBuilder.
As informações de ligação e quiralidade não devem ser ignoradas. Clique nos botões Globo-H, SSEA-4 ou OligoLacNAc para exibir os exemplos. Feche o diálogo GlycanBuilder para concluir a edição.
Defina os parâmetros de pesquisa na guia de configurações do parâmetro para obter resultados razoáveis de pesquisa. Clique no botão ok para ativar novas configurações. A configuração padrão é pesquisar apenas na biblioteca experimental.
Se desejar pesquisar as bibliotecas experimentais e virtuais, selecione a guia de biblioteca de blocos de construção virtual. Selecione usar bibliotecas experimentais e virtuais e aplique filtragem para exibir blocos de construção virtuais com determinados critérios. Blocos de construção experimentais e virtuais podem trabalhar juntos para melhorar a capacidade de pesquisa do Auto-CHO.
Atualmente, o Auto-CHO fornece mais de 50.000 blocos de construção virtuais, com RRVs previstos na biblioteca. Verifique um ou vários blocos de construção virtuais desejados que o usuário gostaria de usar para pesquisar. Clique no botão de blocos de construção virtuais selecionados para mostrar apenas os blocos de construção virtuais selecionados.
Clique no botão de blocos de construção virtuais filtrados para mostrar apenas blocos de construção virtuais com determinados critérios definidos pelo usuário. Clique no botão mostrar todos os blocos de construção virtuais para mostrar todos os blocos de construção virtuais disponíveis e redefinir o filtro. Selecione a guia estrutura de consulta e clique no botão de biblioteca de blocos de pesquisa para encontrar as soluções sintéticas de um pote para a estrutura de consulta.
Em seguida, confirme as configurações do parâmetro. Pesquise o visualizador de resultados. O resultado da pesquisa é mostrado na guia de visualização de resultados.
Os aceitadores finais redutores de diferentes números de resíduos são exibidos na coluna de aceitação final redutora. Em seguida, selecione um aceitador final redutor. As soluções são exibidas na lista de soluções sintéticas.
Fragmentos são mostrados na lista de fragmentos para sugerir quantos fragmentos devem ser usados na síntese. O sistema fornece informações detalhadas de cada fragmento, incluindo o RRV do fragmento, rendimento computacional, bem como qual grupo de proteção deve ser desprotegido para uso do fragmento na reação de um pote. Os blocos de construção usados para montar o fragmento selecionado e as informações de conexão de fragmento também são exibidos.
Para blocos de construção experimentais, visualize e verifique estruturas químicas dos blocos de construção selecionados na estrutura química da região do bloco de construção e consulte o navegador de blocos de construção de informações detalhadas. Em um frasco de fundo redondo de 10 mililitros, combine os dois doadores de tioglicoside, metanol absoluto e secador em DCM. Em seguida, mexa em temperatura ambiente por uma hora.
Pegue uma alíquota de 30 microliter desta mistura e injete a mistura em cromatografia líquida de alto desempenho em três injeções separadas. Meça o coeficiente entre a absorção e a concentração da molécula doadora sob as condições de separação da linha de base. Adicione uma solução de 0,5 molar N-Iodosuccinimida em acetonitrilo na mistura de reação, seguida pela adição de uma solução de ácido trifluorometanessulfônico molar 0,1 molar.
Mexa a mistura em temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, diluir a mistura de reação com quatro mililitros de DCM. Filtre e lave a reação com tiossulfato aquoso de sódio saturado, contendo carbonato de hidrogênio 10%.
Agora extraia a camada aquosa três vezes com cinco mililitros de DCM. Misture todas as camadas orgânicas e lave com cinco mililitros de salmoura. Em seguida, seque as camadas combinadas com aproximadamente 200 miligramas de sulfato de magnésio anidro.
Agite levemente a mistura por 30 segundos e filtre-a através de um funil com um papel filtro de flanada, a fim de remover o sulfato de magnésio. Em seguida, colete o filtrado em um frasco fundo redondo de 25 mililitros. Remova o solvente, usando um evaporador rotativo.
Dissolva o resíduo em um mililitro de DCM. Pegue uma alíquota de 30 microliter desta mistura, e injete-a em cromatografia líquida de alto desempenho em três injeções separadas. Meça as concentrações dos doadores restantes pelo HPLC, sob as mesmas condições de separação.
Meça a reatividade relativa. Com base no valor relativo de reatividade do DR4, o valor relativo de reatividade do DX1 é de três. O resultado de pesquisa Auto-CHO baseado em configurações padrão do parâmetro indica que o SSEA-4 pode ser sintetizado por uma reação de dois mais um mais três de um pote.
Quando um aceitador final redutor de trisacarídeos é selecionado, o programa mostra quatro soluções potenciais para a consulta. A primeira solução tem um fragmento, e seu rendimento calculado é de cerca de 94% O fragmento pode ser sintetizado por dois blocos de construção. O RRV do primeiro bloco de construção descarado é 1462, e o RRV do segundo monossacarídeo é 32.0.
A estrutura química do primeiro bloco de construção sugerido usado na reação de um pote também é mostrada. O experimento de um pote mostra que o SSEA-4 pode ser sintetizado com sucesso em rendimento de 43% por esta sugestão. O SSEA-4 pode ser sintetizado por três unidades sugeridas pelo Auto-CHO.
Essas unidades incluem o bloco de construção de disscarido silele bloco um, edifício monossacarídeo bloco dois, e redução do aceitador final três. Para configurações de parâmetros, sugerimos definir parâmetros com critérios mais rigorosos no início. Para a seleção da biblioteca do bloco de construção, sugerimos pesquisar a biblioteca experimental apenas no início.
Através dessa demonstração, esperamos que glicanos mais importantes, como antígenos de carboidratos associados ao tumor, possam ser sintetizados pela abordagem de um pote para estudos futuros. Após este procedimento, a síntese de todos esses antígenos pode ser realizada a fim de projetar vacinas contra o câncer à base de carboidratos. Também esperamos que a inteligência artificial e algoritmos de computador possam facilitar a síntese automatizada de glicanos para beneficiar o tratamento e a prevenção de doenças.
