Modelos animais confiáveis são componentes cruciais da pesquisa básica. Nossa abordagem murina permite responder perguntas imunológicas sobre a mecanicística e cinética do desenvolvimento de lesões pulmonares agudas em mamíferos. A invasividade mínima, o manuseio simples, bem como a boa reprodutibilidade são as principais vantagens dessa técnica.
Além disso, com a titulação da dose, podemos modular o efeito clínico. Esta técnica reflete a situação clínica de pacientes com lesão pulmonar grave e permite investigar os mecanismos subjacentes. Armazene lipopoliscarídeo, ou LPS, em alíquotas a uma concentração de cinco miligramas por mililitro a menos 20 graus Celsius.
Para instillação intratraqueal, dilui o LPS descongelado em salina tamponada de fosfato estéril para uma concentração final de 2.000 microgramas por mililitro. Corte um cateter venoso de 22 bitolas para um comprimento de 20 milímetros. Coloque o mouse na posição propensa em uma mesa controlada pela temperatura para manter uma temperatura corporal de 37 graus Celsius.
Seguindo a anestesia, conforme descrito no protocolo de texto, aplique lubrificante oftálmico estéril para evitar a dessecação de córneas sob anestesia. Levante os incisivos da cabeça e do gancho em uma barra horizontal posicionada aproximadamente cinco centímetros acima da mesa, enquanto as previs permanecem em contato próximo com a mesa. Super-estender o pescoço em um ângulo de 90 graus em relação à mesa.
Coloque uma fonte de luz fria sobre a pele acima da laringe para ajudar a visualizar as cordas vocais e apontar para a traqueia. Segure a língua com fórceps para endireitar a garganta para condições mais fáceis de entubação. A visualização e identificação adequadas da laringe são fundamentais para garantir a correta colocação intratraqueal do cateter.
Uma fonte externa de luz fria ajuda nesta etapa. Insira o cateter aproximadamente 10 milímetros na traqueia. Certifique-se de que a inserção não é muito profunda, pois isso resultará em instilação unilateral de fluido no brônquio principal direito ou esquerdo.
Se ocorrer resistência à laringe, retraia o cateter alguns milímetros antes de avançar novamente. Agora, injete o MPBS diluído por LPS usando uma pipeta. O volume injetado depende do peso corporal do rato.
Conecte uma seringa e adicione um bolus de 50 microliters de ar para garantir que o volume líquido completo seja distribuído nos pulmões. Remova lentamente o cateter. Mantenha a parte superior do corpo do mouse em posição vertical por 30 segundos para evitar o vazamento do fluido da traqueia.
Fixar o rato eutanizado com fita adesiva em uma mesa de operação e desinfetar a pele sobre o abdômen com 70% de etanol. Abra a cavidade abdominal cuidadosamente na linha mediana com tesouras e pinças. Remova partes do intestino para obter acesso à veia cava inferior à coluna vertebral na aorta abdominal.
Localize as veias renais e insira uma cânula dobrada de 23 bitola conectada a uma seringa de um mililitro na veia cava inferior, diretamente abaixo da confluência das veias. Aspire 250 microliters de sangue e transfira para um tubo de 1,5 mililitro preenchido com 20 microliters de 0,5 solução EDTA molar. Agite suavemente para facilitar a mistura de EDTA e coloque o tubo no gelo.
Para lavagem broncoalveolar, prepare três seringas mililitros, cada uma com 0,5 mililitros de PBS estéril e 0,1 mililitro de ar. Desinfete a pele da garganta com 70% de etanol e exponha cuidadosamente a traqueia com tesouras e pinças. Mobilize a traqueia e enrole uma sutura em torno dela.
Puna a traqueia usando micro-tesoura e insira um cateter venoso de calibre 22, cortado a um comprimento de 20 milímetros. Fixar o cateter com uma sutura e instilado 0,5 mililitros de PBS estéril e 0,1 mililitro de ar. Aspire o fluido depois de 60 segundos.
Repita o procedimento com as duas seringas adicionais e colete todo o aspirado em um tubo de 15 mililitros no gelo. Abra cuidadosamente o tórax com tesouras e pinças para colher os pulmões. Corte o diafragma ao longo da margem costeira e corte as costelas com duas incisões laterais.
Evite perfurar os pulmões. Levante o esterno cranialmente e fixe ou remova-o. Prepare duas seringas de 10 mililitros com PBS quente de 37 graus Celsius.
Faça uma pequena incisão no ventrículo esquerdo. Puna o ventrículo direito com uma cânula calibre 26. Em seguida, lave a circulação pulmonar com um PBS pré-aquecido.
Esteja ciente dos pulmões ficando pálidos durante o procedimento. Remova o lobo direito dos pulmões e corte-o em metades. Esmaá-los em nitrogênio líquido seguido de armazenamento a longo prazo a menos 80 graus Celsius para mais expressão genética e análise de proteínas.
Remova todo o pulmão esquerdo e homogeneize-o em uma placa de 48 poços, picando o tecido com uma tesoura e pinça. Incubar o tecido em dois mililitros de tampão de digestão a 37 graus Celsius por 60 minutos. Realize uma homogeneização adicional, canalização cuidadosa dos pedaços do tecido pulmonar para cima e para baixo.
Transfira as amostras de sangue em cinco tubos FACS mililitros e misture suavemente o sangue com dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Coloque os tubos no gelo e termine a reação após dois minutos adicionando dois mililitros de PBS gelado. Centrifugar a amostra por cinco minutos a 400 vezes g e descartar o supernasal.
Resuspenja a pelota celular com 60 microliters de tampão FACS e processe para posterior coloração FACS de acordo com protocolos descritos anteriormente. Centrifugar fluido BAL por cinco minutos a 400 vezes g. Aspire o supernasciente e congele-o em nitrogênio líquido seguido de armazenamento a longo prazo a menos 80 graus Celsius para análise mais aprofundada da proteína.
Depois de reutilizar a pelota celular BAL com dois mililitros de tampão FACS frio, transfira a suspensão para um tubo FACS de cinco mililitros usando um filtro de malha de 100 mícrons para conter os cabelos. Depois de centrifugar a amostra novamente, resuspenco a pelota com 60 microliters de tampão FACS e processe para posterior coloração FACS de acordo com protocolos descritos anteriormente. Agora, transfira o tecido pulmonar esquerdo digerido para um tubo FACS de cinco mililitros usando um filtro de malha de 100 mícrons para extrair aglomerados.
Termine o processo de digestão adicionando dois mililitros de tampão FACS gelado antes de centrifugar a amostra por cinco minutos a 400 vezes g. Descarte o supernascer e resuspenque a pelota com 60 microliters de tampão FACS e processe para posterior coloração FACS de acordo com protocolos descritos anteriormente. Para uma análise FACS, adicione 20 microliters de solução de bloqueio de anticorpos CD16/CD32 a 60 microliters de células em um tubo de cinco mililitros.
Incubar as células a quatro graus Celsius por 15 minutos para bloquear a ligação inespecífica de imunoglobulina aos receptores Fc. Enquanto isso, prepare uma mistura mestre com tampão FACS e anticorpos, conforme descrito no protocolo de texto. Depois de bloquear, não lave as células.
Adicione 20 microliters de mistura mestre de anticorpos por amostra para obter um volume final de 100 microliters. Incubar as amostras por 20 minutos, no escuro, a quatro graus Celsius. Lave cada amostra com um mililitro de tampão FACS e centrífuga como antes.
Descarte o supernatante e resuspenque a pelota com tampão FACS para a concentração celular apropriada para medições FACS. Finalmente, adicione números fixos de contas de calibração acopladas fluorocromáticas comercialmente disponíveis a cada amostra para determinar números de células absolutas. Realize a citometria de fluxo usando a estratégia de gating mostrada no protocolo de texto para células de sangue, BAL e tecido.
24, bem como 72 horas após a instilação intratraqueal, a expressão de TNF-alfa no tecido pulmonar foi significativamente regulada, atingindo um aumento sustentado e mais de 50 vezes em comparação com os animais de controle. A invasão de leucócitos no tecido e no espaço alveolar é uma marca e característica para o desenvolvimento de lesões pulmonares agudas. A análise do FACS revelou uma infiltração significativa de granulócitos de neutrófilos no interstício pulmonar, com a contagem absoluta de células tendo aumentado quase nove vezes em comparação com os controles após 24 horas.
A contagem absoluta de granulocitos de neutrófilos diminuiu ligeiramente após 72 horas, no entanto, o aumento do fator em relação aos controles permaneceu. Consistente com a infiltração intersticial de nêutrons granulocyte, a expressão MMP-9 em tecido pulmonar inteiro também foi significativamente aumentada durante o período total de observação. Os granulócitos de neutrófilos não foram apenas aumentados no tecido pulmonar, mas também no fluido BAL.
O aumento da dobra em relação aos animais de controle foi mais pronunciado do que no tecido pulmonar. Edema pulmonar devido ao comprometimento grave da barreira alveolocapilária é pathognomônico para o desenvolvimento de lesão pulmonar aguda. A análise do conteúdo de albumen em fluido BAL por ELISA revelou uma perda significativa da função de barreira em 24 horas e 72 horas após a instilação do LPS.
A colocação adequada do cateter é crucial para a instilação bilateral do LPS. Muitas vezes, alterações nos padrões respiratórios, como tosse ou ofegante, indicam instilação intratraqueal correta do fluido. Após a indução de lesão pulmonar aguda, uma série de etapas subsequentes, como análise FACS, PCR, uma detecção de proteína, podem ser realizadas para responder às respectivas perguntas de pesquisa.
