Надежные модели животных являются важнейшими компонентами фундаментальных исследований. Наш муринский подход позволяет отвечать на иммунологические вопросы о механистистии и кинетике развития острой травмы легких у млекопитающих. Минимальная инвазивность, простая управляемость, а также хорошая воспроизводимость являются основными преимуществами этой техники.
Кроме того, с титрами дозы, мы можем модулировать клинический эффект. Этот метод отражает клиническое положение пациентов с тяжелой травмой легких и позволяет исследовать основные механизмы. Храните липополисахарид, или LPS, в алицитах при концентрации в пять миллиграммов на миллилитр при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Для интратрахеальной инститации разбавляют размороженные LPS в стерильном фосфате буферного солевого раствора до конечной концентрации 2000 микрограмм на миллилитр. Вырезать 22-калибровочный венозный катетер длиной 20 миллиметров. Поместите мышь в положение, контролируемое температурой, чтобы поддерживать температуру тела 37 градусов по Цельсию.
После анестезии, как описано в текстовом протоколе, применять стерильные офтальмологические смазки для предотвращения высыхания роговицы под наркозом. Поднимите резцы головы и крючка на горизонтальной полосе, расположенной примерно на пять сантиметров над столом, в то время как предвидели остаются в тесном контакте со столом. Супер-расширить шею в 90 градусов угол по отношению к столу.
Поместите холодный источник света на кожу над гортани, чтобы помочь визуализировать голосовые связки и стремиться к трахее. Держите язык с типсами, чтобы выпрямить горло для облегчения условий инутубации. Правильная визуализация и идентификация гортани имеют решающее значение для обеспечения правильного интратрахального размещения катетера.
Внешний источник холодного света помогает в этом шаге. Вставьте катетер примерно на 10 миллиметров в трахею. Убедитесь, что вставка не слишком глубока, так как это приведет к одностороннему закапывания жидкости в правый или левый основной бронх.
Если сопротивление гортани происходит, втягивать катетер несколько миллиметров, прежде чем продвигаться снова. Теперь ввимите LPS-разбавленный MPBS с помощью пипетки. Впрыскиваемый объем зависит от массы тела мыши.
Подключите шприц и добавьте болюс из 50 микролитров воздуха, чтобы обеспечить полный объем жидкости распределяется в легких. Медленно удалите катетер. Держите верхнюю часть тела мыши в вертикальном положении в течение 30 секунд, чтобы избежать утечки жидкости из трахеи.
Исправить усыпляемой мыши с лентой на столе операции и вскоре дезинфицировать мех над животом с 70%этанола. Откройте брюшную полость тщательно в средней линии с ножницами и пинцетом. Удалите части кишечника для достижения доступа к полости вены уступает право позвоночного столба в брюшной аорты.
Найдите вены почек и вставьте согнутую канюлю 23-го калибра, соединенную с одномиллилитровый шприц, в вену кавы ниже, прямо под слиянием вен. Аспирировать 250 микролитров крови и передавать в 1,5 миллилитровую трубку, наполненную 20 микролитров 0,5 моларного раствора ЭДТА. Встряхните осторожно, чтобы облегчить смешивание EDTA и положить трубку на лед.
Для бронхоальвеолярного лаважа приготовьте три одноми миллилитровых шприца, каждый из которых будет с 0,5 миллилитров стерильного PBS и 0,1 миллилитров воздуха. Дезинфицировать мех горла с 70% этанола и тщательно подвергать трахеи с ножницами и пинцетом. Мобилизовать трахею и обернуть шов вокруг него.
Проколите трахею с помощью микро-ножниц и вставьте 22-калибровочный венозный катетер, разрезанный на длину 20 миллиметров. Зафиксировать катетер с помощью шва и привить 0,5 миллилитров стерильных PBS и 0,1 миллилитра воздуха. Аспирировать жидкость через 60 секунд.
Повторите процедуру с дополнительными двумя шприцами и соберите весь аспират в 15 миллилитровую трубку на льду. Аккуратно откройте грудную клетку ножницами и пинцетом, чтобы собрать легкие. Вырезать диафрагму вдоль стоимости маржи и прорезать ребра с двумя боковой разрезов.
Тщательно избегайте проколов легких. Поднимите грудину черепно-мозговой и исправить или удалить его. Приготовьте два 10 миллилитровых шприца с теплыми, 37 градусами по Цельсию PBS.
Сделайте небольшой разрез в левый желудочек. Проколите правый желудочек 26-калиберной канюлей. Затем промыть легочной циркуляции с предварительно разогретой PBS.
Имейте в виду, легкие бледнеют во время процедуры. Удалить правую долей легких и разрезать его на половинки. Привязать заморозить их в жидком азоте с последующим долгосрочным хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего экспрессии генов и анализа белка.
Удалить все левое легкое и гомогенизировать его в 48-хорошо пластины путем заминки ткани с ножницами и пинцетом. Инкубировать ткани в два миллилитров буфера пищеварения при 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут. Выполните дальнейшую гомогенизацию, тщательно трубя куски легочной ткани вверх и вниз.
Перенесите образцы крови в пять миллилитров facS трубки и аккуратно смешать кровь с двумя миллилитров буфера лиза красных кровяных телец. Положите трубки на лед и прекратить реакцию через две минуты, добавив два миллилитров ледяной PBS. Центрифуга образца в течение пяти минут при 400 раз g и отказаться от супернатанта.
Повторное окрашивание клеточных гранул с 60 микролитров буфера FACS и процесс последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами. Центрифуга BAL жидкости в течение пяти минут при 400 раз г. Аспирировать супернатант и заморозить его в жидком азоте с последующим долгосрочным хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа белка.
После повторного использования гранулы клетки BAL с двумя миллилитров холодного буфера FACS, передать подвеску в пятими миллилитров FACS трубки с помощью 100 микрон сетки фильтр для сдерживания волос. После центрифугирования образца снова, повторно гранулы с 60 микролитров буфера FACS и процесс для последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами. Теперь перенесите переваренную левую легочную ткань в пятими миллилитровую трубку FACS с помощью фильтра сетки емкостью 100 микрон для извлечения комков.
Прекратите процесс пищеварения, добавив два миллилитров ледяного буфера FACS перед центрифугой образца в течение пяти минут при 400 г. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы с помощью 60 микролитров буфера FACS и обработать для последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами. Для анализа FACS добавьте 20 микролитров раствора антител CD16/CD32 в 60 микролитров клеток в пятими миллилитровую трубку.
Инкубировать клетки при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы блокировать неспецифическое связывание иммуноглобулина с рецепторами Fc. Между тем, подготовить мастер смесь с facS буфера и антител, как описано в текстовом протоколе. После блокировки не мыть клетки.
Добавьте 20 микролитров смеси антител на образец, чтобы получить окончательный объем в 100 микролитров. Инкубировать образцы в течение 20 минут, в темноте, при четырех градусах по Цельсию. Вымойте каждый образец с одним миллилитров буфера FACS и центрифуги, как и раньше.
Отбросьте супернатант и повторно поместьте гранулы с буфером FACS в соответствующую концентрацию клеток для измерений FACS. Наконец, добавьте фиксированные числа коммерчески доступных бусинок с флюорохромной калибровкой к каждому образцу, чтобы определить абсолютные числа клеток. Выполняйте цитометрию потока, используя стратегию гэтинга, показанную в текстовом протоколе для клеток крови, BAL и тканей.
24, а также 72 часов после внутритрахеальной закапывания, экспрессия ТНФ-альфа в легочной ткани была значительно upregulated, достигнув устойчивого и более чем в 50 раз больше по сравнению с контроль животных. Вторжение лейкоцитов в ткани и альвеолярное пространство является отличительной чертой и характерной чертой для развития острой травмы легких. Анализ FACS выявил значительное проникновение нейтрофилов гранулоцитов в желудок интерстициум, при этом абсолютное количество клеток увеличилось почти в девять раз по сравнению с контролем после 24 часов.
Абсолютный отсчет нейтрофилов гранулоцитов несколько снизился через 72 часа, однако, увеличение фактора по сравнению с контролем осталось. В соответствии с интерстициальной инфильтрацией нейтрофилов гранулоцитов, экспрессия MMP-9 во всей ткани легких также была значительно увеличена за весь период наблюдения. Нейтрофильные гранулоциты были увеличены не только в легочной ткани, но и в жидкости BAL.
Увеличение створ по сравнению с контрольных животных было более выраженным, чем в легочной ткани. Отек легких из-за тяжелого нарушения альвеолокапильярийного барьера является патогномоническим для развития острой травмы легких. Анализ содержания альбумена в жидкости BAL elISA выявил значительную потерю барьерной функции через 24 часа и 72 часа после закапывания LPS.
Правильное размещение катетера имеет решающее значение для двустороннего закапывания LPS. Часто изменения в дыхательных моделях, таких как кашель или задыхаясь, указывают на правильное интратрахеальной закапывания жидкости. После индукции острой травмы легких, ряд последующих шагов, таких как анализ FACS, ПЦР, обнаружение белка, могут быть выполнены, чтобы ответить на соответствующие вопросы исследования.
