النماذج الحيوانية الموثوقة هي مكونات حاسمة في البحوث الأساسية. يسمح نهجنا في المورين بالإجابة على الأسئلة المناعية حول الميكانيكا والحركات من تطور إصابات الرئة الحادة في الثدييات. الحد الأدنى من الغازية، والتعامل مع بسيطة، فضلا عن إعادة إنتاج جيدة هي المزايا الرئيسية لهذه التقنية.
وبالإضافة إلى ذلك، مع المعايرة الجرعة، يمكننا تعديل الأثر السريري. هذه التقنية يعكس الوضع السريري للمرضى الذين يعانون من إصابات شديدة في الرئة ويسمح للتحقيق في الآليات الكامنة. تخزين الدهون والسكاريد، أو LPS، في aliquots بتركيز خمسة ملليغرام لكل ملليلتر في ناقص 20 درجة مئوية.
للتقطير داخل منطقة اغراء، تخفيف LPS المذاب في الفوسفات المعقم العازل المالحة إلى تركيز نهائي من 2،000 ميكروغرام لكل ملليلتر. قطع قسطرة الوريدية 22 قياسا إلى طول 20 ملليمتر. ضع الماوس في وضعية عرضة على طاولة يتم التحكم فيها بدرجة حرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم من 37 درجة مئوية.
بعد التخدير كما هو موضح في بروتوكول النص، وتطبيق مواد التشحيم معقمة العيون لمنع جفاف القرنيات تحت التخدير. ارفع الرأس وخطاف على شريط أفقي وضعه حوالي خمسة سنتيمترات فوق الطاولة بينما تبقى الفواصل على اتصال وثيق مع الجدول. سوبر تمديد الرقبة في زاوية 90 درجة بالنسبة إلى الجدول.
ضع مصدر ضوء بارد على الجلد فوق الحنجرة للمساعدة في تصور الحبال الصوتية وهدف القصبة الهوائية. عقد اللسان مع ملقط لتقويم الحلق لظروف الانتبيب أسهل. التصور السليم وتحديد الحنجرة أمر بالغ الأهمية لضمان وضع الصحيح داخلالقسطار.
مصدر الضوء البارد الخارجي يساعد في هذه الخطوة. أدخل القسطرة حوالي 10 ملليمترات في القصبة الهوائية. تأكد من أن الإدراج ليس عميقًا جدًا ، لأن هذا سيؤدي إلى تقطير من جانب واحد للسوائل في القصبات الرئيسية اليمنى أو اليسرى.
إذا المقاومة من الحنجرة يحدث، تراجع القسطرة بضعة ملليمترات قبل التقدم مرة أخرى. الآن، حقن MPBS المخففة LPS باستخدام ماصة. يعتمد حجم الحقن على وزن جسم الماوس.
توصيل حقنة وإضافة بول من 50 ميكرولترات من الهواء لضمان توزيع حجم السائل الكامل في الرئتين. إزالة ببطء القسطرة. الحفاظ على الجزء العلوي من جسم الفأر في وضع مستقيم لمدة 30 ثانية لتجنب تسرب السائل من القصبة الهوائية.
إصلاح الماوس القتل الرحيم مع الشريط على طاولة عملية و قريبا تطهير الفراء على البطن مع 70٪ الإيثانول. افتح تجويف البطن بعناية في خط الوسط مع المقص والملاقط. إزالة أجزاء من الأمعاء لتحقيق الوصول إلى الوريد الكافا الحق السفلي إلى العمود الفقري في الشريان الأورطي البطن.
حدد موقع عروق الكلى وأدخل قنية منحنية عيار 23 متصلة بحقنة ملليلتر واحدة في الوريد الكافا السفلي ، مباشرة تحت التقاء الأوردة. pirate 250 ميكرولترات من الدم ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مليئة 20 ميكرولترات من 0.5 EDTA مولا حل. يهز بلطف لتسهيل EDTA خلط ووضع أنبوب على الجليد.
بالنسبة لـ bronchoalveolar lavage ، أعد ثلاث حقن ملليلتر ، كل منها 0.5 ملليلتر من PBS العقيم و 0.1 ملليلتر من الهواء. تطهير فرو الحلق مع الإيثانول 70٪ وفضح بعناية القصبة الهوائية مع مقص وملاقط. تعبئة القصبة الهوائية والتفاف خياطة حولها.
ثقب القصبة الهوائية باستخدام مقص صغير وإدراج قسطرة الوريدية 22 قياس، وقطع إلى طول 20 ملليمتر. إصلاح القسطرة مع خياطة ويغرس 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقمة و0.1 ملليلتر من الهواء. استلهم السائل بعد 60 ثانية.
كرر الإجراء مع حقنتين إضافيتين وجمع التعرق كله في أنبوب 15 ملليلتر على الجليد. فتح الصدر بعناية مع مقص وملاقط لحصاد الرئتين. قطع الحجاب الحاجز على طول هامش costal وقطع من خلال الأضلاع مع اثنين من شقوق جانبية.
تجنب بعناية ثقب الرئتين. ارفع القص عن بُعدياً وأصلحه أو قم بإزالته. إعداد اثنين من 10 ملليلتر الحقن مع دافئ، 37 درجة مئوية PBS.
إجراء شق صغير في البطين الأيسر. ثقب البطين الأيمن مع قنية قياس 26. ثم، تدفق الدورة الدموية الرئوية مع برنامج تلفزيوني مسخ مسبقا.
كن على علم بالرئتين الهاي أثناء العملية. إزالة الفص الأيمن من الرئتين وقطع عليه إلى أنصاف. المفاجئ تجميد لهم في النيتروجين السائل تليها تخزين على المدى الطويل في ناقص 80 درجة مئوية لمزيد من التعبير الجيني وتحليل البروتين.
إزالة الرئة اليسرى كلها وتجانس في لوحة 48 جيدا عن طريق تحديد الأنسجة مع مقص والملاقط. احتضان الأنسجة في مليلترين من عازلة الهضم في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تنفيذ مزيد من التجانس عن طريق الأنابيب بعناية قطع أنسجة الرئة صعودا وهبوطا.
نقل عينات الدم إلى خمسة ملليلتر أنابيب FACS وخلط بلطف الدم مع مليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة. وضع الأنابيب على الجليد وإنهاء رد الفعل بعد دقيقتين عن طريق إضافة ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في 400 مرة ز والتخلص من الفائق.
إعادة تعليق بيليه الخلية مع 60 ميكرولترات من العازلة FACS وعملية لبقعة FACS اللاحقة وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا. سائل بال بال للطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 400 مرة ز. استلهم المابير ويجمّدها في النيتروجين السائل متبوعاً بتخزين طويل الأجل عند ناقص 80 درجة مئوية لمزيد من تحليل البروتين.
بعد إعادة تعليق بيليه خلية بال مع مليلترين من المخزن المؤقت البارد FACS ، قم بنقل التعليق إلى أنبوب FACS من خمسة ملليلتر باستخدام فلتر شبكة 100 ميكرون لكبح الشعر. بعد الطرد المركزي للعينة مرة أخرى، resuspend بيليه مع 60 ميكرولترات من العازلة FACS وعملية لبقعة FACS اللاحقة وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا. الآن، نقل أنسجة الرئة اليسرى المهضمة إلى أنبوب FACS 5 ملليلتر باستخدام مرشح شبكة 100 ميكرون لاستخراج كتل.
إنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة مليلترين من الجليد الباردة FACS العازلة قبل الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في 400 مرة ز. تخلص من المُتطَرَّح والمُنَقّط في البيليه بـ 60 ميكرولترات من العازلة في القوات المسلحة الكونغولية وعملية تلطيخ FACS اللاحقة وفقًا للبروتوكولات الموصوفة سابقًا. لتحليل FACS، إضافة 20 ميكرولترات من CD16/CD32 مانع الأجسام المضادة حل ل60 ميكرولترات من الخلايا في أنبوب 5 ملليلتر.
احتضان الخلايا في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لمنع الربط غير محدد من الغلوبولين المناعي لمستقبلات Fc. وفي الوقت نفسه، إعداد مزيج رئيسي مع العازلة FACS والأجسام المضادة، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد حجب، لا يغسل الخلايا.
إضافة 20 ميكرولترات من الجسم المضاد مزيج سيد لكل عينة للحصول على حجم النهائي من 100 ميكرولترات. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة، في الظلام، في أربع درجات مئوية. اغسل كل عينة بميليلتر واحد من مخزن احتياطي القوات المسلحة الكونغولية والطرد المركزي كما كان من قبل.
تخلص من المُنَاطِع و ينقِر البيليه بمخزن FACS إلى تركيز الخلايا المناسبة لقياسات FACS. وأخيراً، أضف أرقاماً ثابتة من خرزات المعايرة المترافقة مع الفلوروكرروم المتاحة تجارياً إلى كل عينة لتحديد أرقام الخلايا المطلقة. تنفيذ عملية استئصال الخلايا التدفق باستخدام استراتيجية الغاتة هو مبين في بروتوكول النص للدم، BAL، وخلايا الأنسجة.
24 وكذلك 72 ساعة بعد تقطير داخل منطقة المراقبة ، والتعبير عن TNF ألفا في أنسجة الرئة كان أعلى تنظيما كبيرا ، لتصل إلى زيادة مستمرة وأكثر من 50 أضعاف بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة. غزو الكريات البيض في الأنسجة والفضاء السنخي هو السمة المميزة والسمة لتطوير إصابة الرئة الحادة. وكشف تحليل FACS عن تسلل كبير للميقابيب العدلات إلى الخلات الرئوية، مع زيادة عدد الخلايا المطلقة بمقدار تسعة أضعاف تقريبا مقارنة بالضوابط بعد 24 ساعة.
انخفض عدد الحبيبات العدلات المطلقة قليلاً بعد 72 ساعة ، ومع ذلك ، ظلت زيادة العامل مقارنة بالضوابط. واتساقا مع تسلل المحببات الميكروبات الخلالي، زاد التعبير MMP-9 في أنسجة الرئة بأكمله زيادة كبيرة أيضا خلال فترة المراقبة الكلية. لم يتم فقط زيادة حبيبات العدلات في أنسجة الرئة، ولكن أيضا في السائل BAL.
وكانت الزيادة أضعاف بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة أكثر وضوحا مما كانت عليه في أنسجة الرئة. وذمة الرئة بسبب ضعف شديد في الحاجز الحويolocapillary هو pathognomonic لتطوير إصابة الرئة الحادة. تحليل محتوى الألبومات في سائل BAL من قبل ELISA كشف عن فقدان كبير لوظيفة الحاجز في 24 ساعة و 72 ساعة بعد تقطير LPS.
وضع القسطرة السليم أمر بالغ الأهمية للتلقين الثنائي لللبس. غالباً ما تشير التغيرات في أنماط التنفس، مثل السعال أو اللهاث، إلى تقطير السائل داخل الجسم. بعد تحريض إصابات الرئة الحادة، يمكن إجراء عدد من الخطوات اللاحقة، مثل تحليل FACS، PCR، كشف البروتين، للإجابة على الأسئلة البحثية ذات الصلة.
