Uma das principais vantagens dessa técnica para caracterizar transportadores de membrana é que você pode determinar a afinidade relativa do transportador para substratos específicos, bem como obter insights sobre o mecanismo de transporte. A caracterização de proteínas de membrana que usam gradientes proteicos para impulsionar o transporte de substratos é particularmente adequada para este ensaio vesículo de dentro para fora que demonstramos aqui. Embora este ensaio exija alguns equipamentos especializados, como uma imprensa francesa e acesso a uma ultracentrifuagem, achamos que pode ser tecnicamente mais fácil do que ensaios que exigem que transportadores de membrana sejam reconstituídos em lipossomos artificiais.
A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite quantificar as afinidades relativas para diferentes substratos e fazer ensaios de competição para testar o efeito de substratos concorrentes nas grades de transporte. No caso do transportador BAT1 usado para ilustrar este ensaio, também pudemos mostrar ativação substrato do transportador por arginina. Para iniciar este procedimento, cultuam as células mutantes E.coli preparadas que expressam a proteína alvo inoculando uma única colônia em cinco mililitros de poliamina 3 mídia com antibióticos apropriados e cultivando-a durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, transfira essa cultura para 500 mililitros de mídia fresca de poliamina 3 que é suplementada com 0,0002% arabinose e cresça até que a cultura celular atinja um OD600 entre 0,6 e 0,8. Depois disso, centrífuga a 2000 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos para coletar a pelota celular. Suspenda a pelota e lave-a três vezes com tampão uma por centrifugação a 2000 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos cada vez.
O volume final de células em Buffer um após o terceiro giro deve ser de 10 mililitros. Estabeleça uma célula de pressão francesa de 35 mililitros e despeje a suspensão celular no corpo da célula. Ligue a máquina com o interruptor no RHS na parte de trás da unidade e defina o interruptor do seletor de proporção para alto.
Ligue o interruptor da bomba. O pistão começará a subir da base para deslocar o ar na câmara. Aumente a pressão girando a válvula de pressão no sentido horário até que o medidor atinja 640 PSI.
Isso criará uma pressão interna de 10.000 PSI. Uma vez que a célula tenha atingido a pressão alvo, abra ligeiramente o conjunto da válvula de fluxo girando-a no sentido anti-horário. Ajuste a abertura da válvula para permitir uma vazão de apenas cerca de 10 gotas por minuto.
Quando a linha de parada no corpo do pistão atinge a parte superior da célula de fluxo, desligue o interruptor da bomba. Abaixe a placa inferior colocando o interruptor seletor de razão para baixo e, em seguida, ajuste o interruptor da bomba. Quando a placa inferior estiver totalmente retraída, reduza a pressão do sistema a zero, girando a válvula de aumento de pressão totalmente no sentido anti-horário.
Desligue o interruptor da bomba e desligue a máquina. Centrifugar a imprensa francesa eluante a 10.000 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos para remover células ininterruptas e detritos celulares. Descarte a pelota e transfira o supernatante para tubos ultracentrífugas.
Ultracentrificar o supernasce resultante a 150.000 vezes G e a quatro graus Celsius por uma hora para pellet as vesículas da membrana. Lave as vesículas da membrana uma vez sem re-suspensão no tampão dois. Em seguida, use um moedor de tecido Dounce para suspender novamente as vesículas de membrana no tampão dois.
Prepare 100 alíquotas de microliter das preparações da membrana em tubos de centrífugas de 1,5 mililitro e armazene-os a menos de 80 Celsius. Primeiro, lave e suspenda as vesículas em 30 mililitros de Tris no pH 7.8, que contém 0,1 milimilito de cloreto de cobalto II. Adicione um microliter de carboxípeptidase A em cloreto de sódio, tris e cloreto de cobalto II a cada amostra de 100 microliter.
Incubar a 20 graus Celsius por 20 minutos. Adicione cinco microliters de uma solução contendo EDTA de sódio e 2-Mercaptoetanol em PH 7.5 para parar a digestão. Incubar a solução à temperatura ambiente por uma hora para inativar totalmente a enzima.
Em seguida, adicione entre cinco e 10 microliters de uma solução contendo sulfato de dodecil de lítio, glicerol, azul bromofenol e Tris em pH 7,5 a 100 microlitres da amostra e analise amostras por eletroforese. Para realizar a mancha de amino, coloque um filtro de nitrocelulose umedecido com fosfato de hidrogênio de sódio de 25 milimilhas sobre o gel de poliacrilamida. Coloque-os entre dois filtros de celulose umedecidos e, finalmente, entre duas almofadas de limpeza de plástico umedecidas.
Coloque esta montagem entre os eletrodos de uma câmara contendo fosfato de hidrogênio de sódio de 25 milimões a uma temperatura entre dois e quatro graus Celsius. Eletrotransmissão as proteínas a 20 volts e a dois ou três amperes por três horas. Bloqueie a membrana de nitrocelulose no bloqueio do buffer durante a noite a dois graus Celsius.
No dia seguinte, incubar a nitrocelulose a 20 mililitros de um a 5.000 diluições de anticorpo HRP anti-terminal C e tampão de bloqueio por duas horas e lavar duas vezes com 50 mililitros de tampão por um total de 60 minutos. Para visualizar a mancha de amino, dissolva seis miligramas de 4-Cloro-1-naftol em 20 mililitros de álcool desnatado e adicione 80 mililitros de 15 mililitros Tris e 50 microlitros de 30% de peróxido de hidrogênio. Banhe o papel filtro nesta solução de substrato por 20 minutos.
Quando a cor suficiente tiver se desenvolvido, enxágue a membrana com água e deixe secar. Para começar, incubar a alíquota de 100 microliter de vesículas de membrana a 12 graus Celsius por cinco minutos. Adicione o buffer 3 contendo poliaminas radiolabeladas em uma concentração final de 50 micromolar às vesículas de membrana em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mililitros para iniciar o transporte.
Conduza o ensaio de transporte a 12 graus Celsius por um minuto. Depois disso, transfira as misturas de reação para o coletor de filtragem e filtre-as através de um filtro de membrana nitrocelulose de 0,45 micrômetro. Adicione três mililitros de tampão de ensaio gelado contendo uma concentração dez vezes maior de poliaminas não rotuladas, seguido por três mililitros de tampão de ensaio sem as poliaminas para reduzir a ligação não específica.
Transfira os filtros lavados para frascos de cintilação descartáveis de 20 mililitros contendo 10 mililitros de líquido de cintilação e use um contador de cintilação líquida para determinar a radioatividade. Calcule a captação líquida de poliamina conforme descrito no protocolo de texto. Determine o Km para o substrato medindo a absorção de substrato radiolabelado em vesículas expressando a proteína alvo e calcule a cinética Michaelis-Menten usando um método de regressão não linear.
Para os experimentos de competição, adicione o substrato competitivo não rotulado feito no tampão de ensaio ao tubo de centrífuga contendo 100 microliters de vesículas a 12 graus Celsius, adicionando simultaneamente 50 micromolar da poliamina radiolabelada. Meça a radioatividade presa dentro das vesículas como descrito anteriormente. Determine um KM pai para os substratos competitivos medindo a absorção de poliaminas radiolabeladas e a presença de 100 micromolar ou substrato não rotulado e use um método de regressão não linear para traçar a curva.
Neste estudo, um anti-porter é caracterizado por primeiro expressar a proteína em E.coli e, em seguida, gerar vesículas de membrana para que a proteína heterologosamente expressa possa ser avaliada em um sistema livre de células. Uma mancha ocidental é usada para verificar se o AtBAT1 é translocado para vesícula. Sondar a mancha com um anticorpo anti-seu terminal C revelou uma proteína de construção de fusão que é aproximadamente 72,3 kilodaltons.
A digestão das vesículas anteriores ao SDS-PAGE resultou em uma diminuição, mas não uma perda completa do sinal da sonda. A 12 graus Celsius, tomar uma espermidina radiolabeled pelas vesículas é mais alta em um minuto e permaneceu linear durante três minutos. Portanto, o tempo de incubação do ensaio de transporte é fixado em um minuto.
Após um minuto, não há absorção líquida de isótopo por vesículas de membrana que foram preparadas e armazenadas em pH 8.0, pois não há gradiente de prótons através da membrana vesícula. Para demonstrar o efeito da dissipação do gradiente artificial de prótons, as vesículas de membrana são incubadas em tampão pH 8.0 por 10 minutos antes da adição de substrato rotulado, levando a uma absorção mínima de substrato radiolabeled. Juntos, esses resultados indicam que a absorção de espermidina impulsionada por prótons deve-se à proteína BAT1.
Para determinar a especificidade do substrato da proteína, os valores km são calculados medindo a absorção de substrato radiolabeled em diferentes concentrações. Os valores km para espermidina, putrescina e arginina indicam que essa proteína é um trocador de poliamina e arginina de alta afinidade. A afinidade do transportador para um determinado substrato também pode ser determinada indiretamente usando ensaios de concorrência.
Estes ensaios revelam que o GABA é um inibidor competitivo da espermidina. Além disso, medir a absorção de 50 micromolar de espermidina radiolabeled na presença de concentrações variadas de diferentes aminoácidos revela que o AtBAT1 também é capaz de transportar glutamato e alanina em concentrações mililameadas. Ao realizar este procedimento, a integração do transportador de membrana na membrana bacteriana é, obviamente, crítica.
A verificação de que a proteína de interesse é integrada à membrana pode ser feita usando anticorpos direcionados contra as etiquetas terminais C. A variação genética dos transportadores humanos pode afetar o transporte de, tanto metabólicos quanto de drogas que são substratos do transportador particular. Assim, a variação allelic pode afetar, tanto, a absorção e a excreção de drogas.
Muitas variantes allelic podem ser rapidamente feitas por mutagênese direcionada lateral do gene transportador em um vetor de expressão. Ensaios funcionais dessas variantes podem então ser testados em condições muito controladas usando ensaios de vesícula de dentro para fora. Os transportadores de membrana constituem de 8 a 10 de todas as proteínas e a maioria não foi caracterizada completamente em nenhum dos organismos modelo.
Transportadores localizados a membranas organela são particularmente desafiadores para caracterizar pela expressão heteróloga em células eucarióticas. Se o tipo de troca ou transportadores mediados por prótons podem ser localizados nesta membrana E.coli, esses transportadores podem ser caracterizados funcionalmente usando este ensaio in vitro. A qualidade e o rendimento das vesículas são afetados pela taxa de eluição de fragmentos celulares da imprensa francesa.
Ao fazer ensaios de transporte de vesículas com isótopos, é importante ter uma configuração experimental que facilite a realização de réplicas experimentais. Há muitas maneiras de fazer isso, mas achamos que será útil para nós mostrar como fizemos isso.
