A APL reconhece o apoio da National Science Foundation (EF1935265), dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-EB030031 e R21-AR080363) e do Escritório de Pesquisa do Exército (80523-BB)

Os reagentes e equipamentos utilizados para este estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Reações de CFE em massa na presença de pequenas vesículas unilamelares (SUVs)
<ol><li>Preparação para SUV NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma hotte seguindo as instruções de segurança para trabalhar com clorofórmio.<ol><li>Prepare 5 mM de SUVs de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) em um frasco de vidro, transferindo 76 μL de solução estoque de POPC de 25 mg / mL dissolvida em clorofórmio.</li>
		<li>Enquanto gira suavemente o frasco de vidro, sopre um fluxo suave de argônio no frasco para formar uma película de lipídios secos no fundo. Em seguida, transfira o frasco de vidro para um dessecador com a tampa frouxamente aparafusada para evaporar o excesso de clorofórmio.</li>
		<li>Mantenha o frasco de vidro no exsicador por 1 h. Em seguida, adicione 0,5 mL de água deionizada ultrapura para dissolver o filme lipídico e o vórtice por aproximadamente 2 min.</li>
		<li>Configure um aparelho de miniextrusão embebendo dois suportes de filtro em água deionizada e colocando-os em cada um dos suportes internos da membrana. Em seguida, embeba um filtro de policarbonato de 100 nm e coloque-o entre os dois suportes internos da membrana mantidos juntos pelo invólucro externo da extrusora e pela porca de retenção. Coloque esta configuração no suporte da extrusora.</li>
		<li>Lave duas seringas estanques a gás de 1 mL 3 vezes com água deionizada ultrapura.</li>
		<li>Carregue a amostra de mistura lipídica-água em uma das seringas estanques a gás de 1 mL e coloque-a em uma extremidade da mini extrusora usando os clipes do braço oscilante para manter a seringa no lugar. Insira a segunda seringa na outra extremidade da miniextrusora e certifique-se de que esteja totalmente pressionada. NOTA: Ao carregar a seringa com a mistura lipídica-água, certifique-se de que não há ar na seringa antes de passá-la pela miniextrusora.</li>
		<li>Passe suavemente a mistura lipídica-água da seringa original para a seringa vazia através do aparelho miniextrusora. Repita esta etapa 11 vezes para formar SUVs. Transfira os SUVs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: A solução SUV pode ser armazenada a 4 °C por até 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Conjunto de reação CFE<ol><li>Monte a reação CFE seguindo o protocolo de expressão livre de células fornecido pelo fabricante com pequenas modificações detalhadas a seguir.</li>
		<li>Misture 10 μL da Solução 1 (contendo aminoácidos, NTPs, tRNAs e substratos para enzimas e tampão necessário), 1 μL de Solução 2 (proteínas em glicerol a 20%), 2 μL de Solução 3 (ribossomo (20 μM)), quantidade apropriada do DNA que codifica para sfGFP-sfCherry solúvel (1-10) 27 (doravante referido como sfGFP solúvel), WT-GluR0-sfGFP ou PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng / 1000 pares de bases), 1 μL de inibidor de RNAse murina e 4 μL de solução SUV 5 mM para proteínas de membrana ou 4 μL de água para proteínas solúveis.</li>
		<li>Traga o volume final da reação para 20 μL adicionando água deionizada ultrapura. NOTA: Ao montar o sistema CFE, todos os componentes devem ser mantidos no gelo. Todos os materiais são sensíveis à temperatura e podem se degradar se atingirem a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubação e monitoramento da reação CFE<ol><li>Transfira a solução CFE para uma placa cônica de fundo em V de 96 poços. Para evitar a evaporação durante o curso da reação, cubra a placa com um filme de vedação.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 °C num leitor de placas durante 4-5 h enquanto monitoriza a reação CFE medindo o sinal GFP com um ganho de 100 a comprimentos de onda de excitação/emissão de 488 nm/528 nm a cada 2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reações CFE encapsuladas em GUVs
<ol><li>Preparação da solução tampão externa GUV<ol><li>Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture 1,5 μL de espermidina 1 M, 37,5 μL de ATP 100 mM, 25 μL de GTP 100 mM, 12,5 μL de CTP 100 mM, 12,5 μL de UTP 100 mM, 25 μL de fosfato de creatina 1 M, 18 μL de acetato de magnésio 1 M, 93,33 μL de glutamato de potássio 3 M, 50 μL de 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL de ácido folínico 332 mM, 100 μL de glicose 2 M e 50 μL de solução estoque de mistura 6 mM de cada um dos 20 aminoácidos (preparados seguindo o protocolo descrito por Sun et al.28).</li>
		<li>Traga o volume final da solução para 1 mL adicionando água deionizada ultrapurificada. NOTA: Todos os componentes devem ser mantidos no gelo. Adicione a mistura de aminoácidos no final para evitar a depleção de aminoácidos28. A solução pode ser alíquota em alíquotas de 330 μL e conservada a -20 °C até à utilização.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da mistura lipídica em óleo NOTA: esta etapa deve ser realizada em uma hotte seguindo as instruções de segurança para trabalhar com clorofórmio.<ol><li>Em uma capela de exaustão, misture 17,3 μL de solução estoque de POPC 25 mg / mL e 1,08 μL de copolímero de poli (butadieno) -b-poli (óxido de etileno) (PEO-b-PBD) de 50 mg / mL em um frasco de vidro de 15 mL. NOTA: A solução final de lipídio em óleo contém 0,5 mM de lipídio com 95% e 5% de POPC e PEO-b-PBD, respectivamente. PEO-b-PBD foi usado para aumentar a estabilidade da membrana durante a expressão da proteína, mas foi mantido em uma proporção molar baixa para reduzir a tendência do copolímero de se agregar em micelas separadas das moléculas lipídicas29,30.</li>
		<li>Sopre cuidadosamente um fluxo suave de gás argônio no frasco de vidro enquanto gira o frasco para evaporar o clorofórmio.</li>
		<li>Pipete 1,2 mL de óleo mineral leve no frasco de vidro de 15 mL contendo os lipídios secos.</li>
		<li>Misture os lipídios e o óleo por vórtice na velocidade máxima por 10-20 s. A mistura de lipídio-copolímero dissolvida parecerá turva.</li>
		<li>Para garantir que todos os agregados lipídicos possíveis no óleo sejam totalmente dissolvidos e dispersos por todo o óleo, coloque o frasco de vidro em um forno a cerca de 50 ° C por 20 min antes do vórtice por mais 10-20 s na velocidade máxima.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem e encapsulamento da reação CFE (a Figura 1 resume as etapas a seguir).<ol><li>Prepare 300 μL da solução externa GUV em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL misturando 270 μL de solução tampão externa CFE preparada na etapa 2.1, 15 μL de NaCl 5 M e 15 μL de KCl 4,5 M. NOTA: Nesta etapa, adicione 0.45 μL de 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT) à solução externa de GUV. O objetivo da adição de NaCl e KCl é ajustar a osmolalidade da solução externa para combiná-la com a solução interna de CFE. O volume exato de NaCl e KCl depende do ajuste de osmolalidade desejado. Pode-se adicionar NaCl ou KCl ou ambos para ajustar a osmolalidade.</li>
		<li>Pipete suavemente 300 μL de mistura lipídica em óleo sobre a solução externa GUV. NOTA: Ao adicionar a mistura lipídica-óleo, é importante que o óleo não se misture com a solução externa aquosa. Após a adição, deve haver uma interface visível entre a mistura lipídica em óleo e a solução externa de GUV.</li>
		<li>Incubar a interface óleo-água à temperatura ambiente durante 2 h para permitir que a monocamada lipídica se forme e se estabilize na interface.</li>
		<li>Enquanto isso, siga a seção 1.2.1 para montar uma reação CFE contendo o DNA do plasmídeo que codifica as variantes da proteína de membrana ou GFP solúvel. Substitua os 4 μL de solução SUV 5 mM ou água por 4 μL de sacarose 1 M. Essa reação será a solução interna do GUV. NOTA: Um osmômetro foi usado para medir a osmolalidade das soluções interna e externa. A osmolalidade da solução externa foi então ajustada de acordo com a adição de NaCl ou água. A osmolalidade da reação CFE é tipicamente em torno de 1600 mOsm/Kg. A adição de sacarose à reação aumenta a densidade da solução interna, permitindo assim que as vesículas viajem pela interface óleo-água durante a etapa de centrifugação. Uma alternativa à sacarose é a solução de gradiente de densidade Opti-Prep.</li>
		<li>Adicione 600 μL de mistura lipídica-óleo ao tubo de microcentrífuga contendo a reação CFE e pipete para cima e para baixo vigorosamente por ~ 1 min para emulsionar a reação em solução lipídica em óleo e formar a monocamada lipídica ao redor das células sintéticas. NOTA: A solução final não deve ter bolhas e deve parecer opaca.</li>
		<li>Pipete suavemente a emulsão da solução interna sobre a camada de óleo no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL onde a interface óleo-água foi configurada. NOTA: Tenha cuidado para não perturbar ou desestabilizar a interface.</li>
		<li>Centrifugue por 10 min a 2.000 x g a 4 °C. NOTA: A velocidade de centrifugação foi otimizada para este protocolo. Adir et al.31 relataram uma velocidade de centrifugação diferente.</li>
		<li>Terminada a centrifugação, remova cuidadosamente o excesso de óleo e a solução externa do tubo da microcentrífuga usando um pipetador. Remover a solução externa até que o volume restante esteja em torno de 100 μL. NOTA: Um pellet de GUVs geralmente é visível na parte inferior do tubo da microcentrífuga. No entanto, a falta de um pellet visível não significa necessariamente nenhum rendimento GUV. Em vez de usar um pipetador, o excesso de óleo em cima da solução externa pode ser removido por aspiração. É fundamental garantir que a solução lipídica em óleo seja completamente removida. A contaminação por óleo na solução GUV pode causar imagens de baixa qualidade.</li>
		<li>Ressuspenda o grânulo GUV na solução de 100 μL restante, pipetando suavemente para cima e para baixo. Em seguida, transfira a solução GUV para uma placa de fundo plano limpa de 96 poços para incubar.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Incubação e imagem de reação CFE encapsulada
<ol><li>Cubra a placa usando um filme de vedação para evitar a evaporação. Incubar a placa a 37 °C durante 5-6 h. Pode-se usar um leitor de placas e seguir a etapa 1.3.2 para preparar o leitor de placas para a etapa de incubação.</li>
	<li>Quando a incubação terminar, coloque a placa de 96 poços no estágio de imagem de um microscópio invertido equipado com uma câmera EMCCD (ou uma câmera sCMOS), laser controlado por DAQ-MX (ou um sistema combinador de laser integrado) e um confocal de disco giratório CSU-X1 (ou um confocal de varredura a laser). Concentre-se em qualquer ROI contendo GUVs e capture imagens em um comprimento de onda de excitação de 488 nm usando uma objetiva Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.</li>
	<li>Salve imagens de GUVs no formato .tiff.</li>
	<li>Abra as imagens em um software de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ ou Fiji). Abra o painel de configuração Brilho/Contraste . Ajuste o brilho e o contraste para as configurações apropriadas que tornam as proteínas fluorescentes visíveis.</li>
	<li>Se o objetivo for comparar a intensidade do sinal de diferentes proteínas expressas, primeiro empilhe imagens individuais de GUVs contendo diferentes proteínas usando o painel Imagens para empilhar localizado no submenu Pilhas de > de imagens . Em seguida, ajuste o brilho e o contraste de todas as imagens usando o painel Brilho/Contraste .</li>
</ol>

Expressão Livre de Células de Proteínas de Membrana em Vesículas Unilamelares Gigantes

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+cell-free+biology.">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA.">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).</li><li>Poddar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+stretching+activates+calcium+permeability+of+a+putative+channel+Pkd2+during+fission+yeast+cytokinesis.">Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis.</a> MBoC. 33 (14), (2022).</li><li>Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+synthesis+in+cell-free+systems:+From+bio-mimetic+systems+to+bio-membranes.">Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).</li><li>Dondapati, S. 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Y., Groaz, A., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+platforms+of+mammalian+cell-free+expressed+membrane+proteinsmembrane+proteins.">In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).</li><li>Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis.">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429 (2021).</li><li>Steink&#252;her, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation.">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+potassium-selective+prokaryotic+glutamate+receptor.">Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor.</a> Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hsu, Y. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Praticamente qualquer processo celular que dependa da transferência de moléculas ou informações através da membrana celular, como sinalização celular ou excitação celular, requer proteínas de membrana. Assim, a reconstituição de proteínas de membrana tornou-se o principal gargalo na realização de vários projetos de células sintéticas para diferentes aplicações. A reconstituição tradicional mediada por detergente de proteínas de membrana em membranas biológicas requer métodos de geração de GUV, ...

A biologia sintética de baixo para cima ganhou interesse crescente na última década como um campo emergente com inúmeras aplicações potenciais em bioengenharia, administração de medicamentos e medicina regenerativa 1,2. O desenvolvimento de células sintéticas como pedra angular da biologia sintética de baixo para cima, em particular, atraiu uma ampla gama de comunidades científicas devido às aplicações promissoras de células sintéticas, bem como suas propriedades físicas e bioquímicas semelhantes a células que facilitam estudos biofísicos in vitro 3,4,5,6 . As células sintéticas são frequentemente projetadas em vesículas unilamelares gigantes do tamanho de células (GUVs) nas quais diferentes processos biológicos são recriados. A reconstituição do citoesqueleto celular 7,8, a regeneração de energia dependente de luz9, a comunicação celular10,11 e o biossensoriamento12 são exemplos de esforços feitos para reconstruir comportamentos semelhantes a células em células sintéticas.
Embora alguns processos celulares dependam de proteínas solúveis, muitas características das células naturais, como detecção e comunicação, geralmente utilizam proteínas de membrana, incluindo canais iônicos, receptores e transportadores. Um grande desafio no desenvolvimento de células sintéticas é a reconstituição de proteínas de membrana. Embora os métodos tradicionais de reconstituição de proteínas de membrana em bicamadas lipídicas dependam da purificação mediada por detergente, tais métodos são trabalhosos, ineficazes para proteínas tóxicas para o hospedeiro de expressão ou muitas vezes não são adequados para a reconstituição de proteínas de membrana em GUVs13.
Um método alternativo para a expressão de proteínas são os sistemas de expressão livre de células (CFE). Os sistemas CFE têm sido uma ferramenta poderosa na biologia sintética que permite a expressão in vitro de várias proteínas usando lisado celular ou maquinário de transcrição-tradução purificado14. Os sistemas CFE também podem ser encapsulados em GUVs, permitindo assim reações de síntese de proteínas compartimentadas que podem ser programadas para várias aplicações, como a criação de células sintéticas coletoras de luz9 ou biossensores mecanossensíveis15,16. Análoga aos métodos de expressão de proteínas recombinantes, a expressão de proteínas de membrana é desafiadora em sistemas CFE17. Agregação, dobramento incorreto e falta de modificação pós-traducional em sistemas CFE são os principais gargalos que impedem a síntese bem-sucedida de proteínas de membrana usando sistemas CFE. A dificuldade de reconstituição de proteínas de membrana de baixo para cima usando sistemas CFE se deve em parte à ausência de uma via complexa de biogênese de proteínas de membrana que dependa de peptídeos de sinal, partículas de reconhecimento de sinal, translocões e moléculas de acompanhamento. No entanto, recentemente, vários estudos sugeriram que a presença de estruturas membranosas, como microssomas ou lipossomas durante a tradução, promove a expressão bem-sucedida de proteínas de membrana 18,19,20,21. Além disso, Eaglesfield et al. e Steinküher et al. descobriram que a inclusão de domínios hidrofóbicos específicos conhecidos como peptídeos sinal no terminal N da proteína de membrana pode melhorar significativamente sua expressão22,23. Em conjunto, esses estudos sugerem que o desafio da reconstituição da proteína de membrana em células sintéticas pode ser superado se a tradução da proteína ocorrer na presença da membrana GUV e se o peptídeo sinal N-terminal adequado for utilizado.
Aqui, é apresentado um protocolo para encapsulamento da síntese proteica usando reações CFE de elementos recombinantes (PURE) para reconstituição de proteínas de membrana em GUVs. O receptor bacteriano de glutamato24 (GluR0) é selecionado como a proteína modelo de membrana, e o efeito de seu peptídeo sinal N-terminal em sua reconstituição de membrana é estudado. O efeito do peptídeo sinal de proteorodopsina, que demonstrou melhorar a eficiência de reconstituição da proteína de membrana por Eaglesfield et al.22, é investigado pela construção de uma variante mutada de GluR0 denotada como PRSP-GluR0 e sua expressão e localização de membrana com GluR0 de tipo selvagem (referido como WT-GluR0 a seguir) que abriga seu peptídeo sinal nativo é comparado. Este protocolo é baseado no método de emulsão invertida25 com modificações que o tornam robusto para encapsulamento CFE. No método apresentado, as reações de CFE são primeiro emulsionadas usando uma solução lipídica em óleo que gera gotículas de tamanho mícron que contêm o sistema CFE e são estabilizadas pela monocamada lipídica. As gotículas de emulsão são então colocadas em camadas sobre uma interface óleo-água saturada com outra monocamada lipídica. As gotículas de emulsão são então forçadas a viajar através da interface óleo-água por meio de força centrífuga. Por meio desse processo, as gotículas obtêm outra monocamada, gerando assim uma vesícula lipídica de bicamada. Os GUVs contendo a reação CFE são então incubados, durante os quais a proteína de membrana é expressa e incorporada à membrana GUV. Embora este protocolo seja especificado para expressão livre de células de GluR0, ele pode ser usado para síntese livre de células de outras proteínas de membrana ou diferentes aplicações de células sintéticas, como reconstituição de citoesqueleto ou estudos de fusão de membrana26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

Os sistemas de expressão livre de células (CFE) são ferramentas poderosas em biologia sintética que permitem a biomimética de funções celulares como biossensoriamento e regeneração de energia em células sintéticas. A reconstrução de uma ampla gama de processos celulares, no entanto, requer a reconstituição bem-sucedida das proteínas da membrana na membrana das células sintéticas. Embora a expressão de proteínas solúveis seja geralmente bem-sucedida em sistemas CFE comuns, a reconstituição de proteínas de membrana em bicamadas lipídicas de células sintéticas provou ser um desafio. Aqui, é demonstrado um método para reconstituição de uma proteína de membrana modelo, receptor bacteriano de glutamato (GluR0), em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) como células sintéticas modelo baseado na encapsulação e incubação da reação CFE dentro de células sintéticas. Utilizando esta plataforma, é demonstrado o efeito da substituição do peptídeo sinal N-terminal de GluR0 por peptídeo sinal de proteorodopsina na translocação cotranslacional bem-sucedida de GluR0 em membranas de GUVs híbridos. Este método fornece um procedimento robusto que permitirá a reconstituição livre de células de várias proteínas de membrana em células sintéticas.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

Autor em destaque: Reconstituição de proteínas de membrana em células sintéticas

Reconstituição do canal receptor de glutamato bacteriano por encapsulamento de um sistema de expressão livre de células

Our protocol addresses the reconstitution of a membrane protein within the lipid bilayer of a synthetic cell made using the inverted droplet emulsion method. The advantage of using the inverted droplet emulsion method is its ability to generate synthetic cells that provide a stable environment for the cell-free expression of membrane proteins. Our protocol offers a robust method for researchers in the field to synthesize membrane proteins inside synthetic cells using cell-free expression system.My lab is working on reconstituting various ion channels in synthetic cells through the reconstitution of the action potential by a well-defined set of ion channels.

Antes do encapsulamento das reações CFE, duas variantes de GluR0-sfGFP contendo peptídeos sinais nativos e proteorodopsina (as sequências de peptídeos sinal são apresentadas na Tabela Suplementar 1) e o sfGFP solúvel foram expressos individualmente em reações em massa, e sua expressão foi monitorada pela detecção do sinal sfGFP usando um leitor de placas (Figura 2A). As proteínas de membrana foram expressas na ausência ou presença de SUVs de...

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Este protocolo descreve o método de emulsão invertida usado para encapsular um sistema de expressão livre de células (CFE) dentro de uma vesícula unilamelar gigante (GUV) para a investigação da síntese e incorporação de uma proteína de membrana modelo na bicamada lipídica.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Nosso protocolo aborda a reconstituição de uma proteína de membrana dentro da bicamada lipídica de uma célula sintética feita usando o método de emulsão de gotículas invertidas. A vantagem de usar o método de emulsão de gotículas invertidas é sua capacidade de gerar células sintéticas que fornecem um ambiente estável para a expressão livre de células de proteínas de membrana. Nosso protocolo oferece um método robusto para pesquisadores da área sintetizarem proteínas de membrana dentro de células sintéticas usando o sistema de expressão livre de células.Meu laboratório está trabalhando na reconstituição de vários canais iônicos em células sintéticas por meio da reconstituição do potencial de ação por um conjunto bem definido de canais iônicos.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

787 visualizações.  University of Michigan, Ann Arbor. Nosso protocolo aborda a reconstituição de uma proteína de membrana dentro da bicamada lipídica de uma célula sintética feita usando o método de emulsão de gotículas invertidas. A vantagem de usar o método de emulsão de gotículas invertidas é sua capacidade de gerar células sintéticas que fornecem um ambiente estável para a expressão livre de células de proteínas de membrana. Nosso protocolo oferece um método robusto para pesquisadores da área sintetizarem proteínas de m...

Vídeo: Autor em destaque: Reconstituição de proteínas de membrana em células sintéticas

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.

Bioengenharia

Bulk Cell-Free Expression Reactions with Small Unilamellar Vesicles (SUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, blow a gentle stream of Argonne into a glass vial containing POPC lipids while gently rotating the vial. When the lipids have dried as a film at the bottom of the vial, loosely cap it, then transfer it to a desiccater. After one hour add 0.5 milliliters of ultrapure deionized water to dissolve the lipid film.Vortex the solution for two minutes. Next, soak two filter supports and deionized water. Place them on each of the internal membrane supports.Then place a 100 nanometer polycarbonate filter between the two internal membrane supports, held together by the extruder outer casing and retainer nut. Place the setup in the extruder stand to finish setting up the mini extrusion apparatus. Next, load the lipid water mix into a one milliliter gast tight syringe.Use swing arm clips to secure the syringe into one end of the mini extruder. Insert the second syringe into the other end of the mini extruder, making sure that it is fully depressed. Now pass the lipid water mix from the original syringe into the empty one through the apparatus.After repeating the extrusion 11 times, transfer the SUVs to a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. To assemble the cell-free expression protocol, pipette solutions one to 3 DNA plasmid encoding for soluble SFGFP or variants of glutamate receptor SFGFP, murine RNAse, and SUV solution into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Transfer the cell-free expression solution to a 96 well conical V bottom plate. Incubate the plate in a plate reader at 37 degrees Celsius for four to five hours. Set up the plate reader with a gain of 100, excitation of 485 nanometers, emission of 528 nanometers, a runtime of five hours, and an interval measurement of one read for every two minutes.Measure the GFP signal every two minutes to monitor the cell-free reaction in real time. Soluble SFGFP had the highest expression among all three proteins.

Reações de Expressão Livre de Células em Massa com Pequenas Vesículas Unilamelares (SUVs) para Aplicações em Células Sintéticas

Cell-Free Reactions in Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, prepare the GUV outer buffer solution in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Mixed together spermidine, ATP, GTP, CTP, UTP, creatine phosphate, magnesium acetate, potassium glutamate, HEPES, potassium hydroxide, folinic acid. glucose, and amino acid stock.Add ultra purified deionized water to bring the final volume of the solution to one milliliter. Next, in a fume hood, add 17.3 microliters of POPC stock solution to a 15-milliliter glass vial. To this, pipette 1.08 microliters of PEO-b-PBD copolymer.Carefully blow a gentle stream of argon gas into the glass vial while rotating the vial to evaporate the chloroform. Then pipette 1.2 milliliters of light mineral oil into the glass vial. Vortex the lipid and oil at maximum speed for 10 to 20 seconds.Place the glass vial in an oven at around 50 degrees Celsius for 20 minutes before vortexing for an additional 10 to 20 seconds at maximum speed. Next, pipette 270 microliters of the GUV outer solution into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. To this, pipette 15 microliters each of five molar sodium chloride and 4.5 molar potassium chloride.Gently pipette 300 microliters of lipid and oil mixture on top of the GUV outer solution. After incubation, assemble a CFE reaction by pipetting Solutions 1 to 3, DNA plasmid encoding for soluble sfGFP or variants of glutamate receptor sfGFP, murine RNAse, and one molar sucrose into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Add 600 microliters of the lipid-oil mixture to the microcentrifuge tube containing the 20-microliter reaction mixture. Pipette up and down vigorously for one minute to emulsify the reaction. Gently layer the inner emulsion on top of the oil layer in the tube.Centrifuge for 10 minutes at 2000 g at four degrees Celsius. Next, carefully pipette out the excess oil and outer solution from the microcentrifuge tube. Gently mix the GUV pellet in the remaining solution to resuspend it.Transfer the GUV solution to a clean 96-well clear flat bottom plate for incubation. Transfer the sealed plate into a plate reader to incubate at 37 degrees Celsius for five to six hours. After incubation, place the plate on an inverted confocal microscope.Focus on a region of interest containing the GUVs, then capture the images at an excitation wavelength of 488 nanometers. Save the images in the TIFF format. Open the images in an image processing software.Click on the Brightness/Contrast setting panel to open it. Then adjust the brightness and contrast to make the fluorescent proteins visible. The wild-type glutamate receptor cell-free expression reactions encapsulated in GUV demonstrated excellent expression and membrane localization.PRSP-glutamate receptor was prone to aggregation and punctate formation. The soluble sfGFP was expressed in GUVS and stayed in the GUV lumen.