Este protocolo é nosso método baseado em células para o término do colesterol do refluxo de colesterol no plasma ceramal. Especialmente em exibições. Isso pode ser aplicado para diagnosticar o risco cardiovascular e identificar ou avaliar a menor manutenção do colesterol.
Esta técnica evita o risco e os encargos como a segurança para lidar com materiais irradiados, fornecendo resultados com níveis de qualidade comparáveis, para os refluxo de colesterol foi relatado para associar-se assim, o refluxo de plasma ou colesterol ceramal de aceito pode ser comparado, ao nosso controle de referência e pode fornecer o risco de sofrer com este método também será aplicado às linhas celulares , como outras linhas celulares humanas ou mesmo fases macro primárias. Fases macro ou células-tronco de spray induzidos pelo homem. Para iniciar este procedimento, dissolva o colesterol NPD em etanol puro para obter uma solução de estoque com uma concentração final de dois micromolar.
Diluir 25 microliters do estoque de colesterol NBD em média AR 10 para atingir uma concentração final de cinco micromolar. Cultura thp-1 células em nossos 10 médios a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono. A cada três dias, ajuste a densidade celular para 300.000 células por mililitro.
Em seguida, obtenha uma placa de 96 poços com um fundo liso claro. Para uma melhor homogeneização, prepare 10 mililitros de células thp-1 em um tubo de 15 mililitros e adicione 200 microliters de estoque pma. Misture suavemente e sementes 100 microliters da mistura nos poços da placa a 200.000 células por poço.
E incubar a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 a 72 horas para diferenciar as células thp-1 em células DM thp-1. Primeira glicina diluída em 10%PBS com água estéril, para uma concentração de 200 micromolar em pH 7.4. Adicione 40 mililitros de glicina diluída a 10 gramas de pinos 8000 para preparar uma solução de 20% de pinos, e misture vigorosamente para homogeneizar.
Em seguida, aplique quatro partes de 20% por 10 partes da amostra em cada amostra de soro ou plasma em um tubo de 1,5 ml. Deixe a mistura no gelo por 25 minutos. Centrifugar a apolipoproteína B precipitada a 13.000 vezes G, e a 4 graus celsius por 15 minutos.
Descarte o precipitado e transfira o supernante para um novo tubo. Recupere a placa contendo as células thp-1 diferenciadas. Remova e descarte o meio de cultura e, em seguida, lave as células duas vezes com 1X PBS.
Adicione 100 microliters de 5 colesterol MVD micromolar em meio AR-10 para cada poço. Incubar durante a noite a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte descarte, descarte o meio.
Lave as células duas vezes com PBS e adicione 100 microliters ABDS, ou acceptor lipídico purificado diluído em rpmi 1630 médio à concentração desejada a cada poço. Inclua um controle negativo que não contenha aceitadores de colesterol em um controle positivo, como descrito no protocolo de texto, e incubar a 37 graus celsius por quatro a seis horas. Enquanto isso, prepare um estoque de 200 mililitros de solução de lise celular, conforme descrito no texto.
Misture esta solução com etanol, em uma relação volumosa de um para um para obter solução de lise também. Para detecção de colesterol de mídia e BD, remova o meio celular das placas coletadas em uma nova placa branca de 96 poços com um fundo plano opaco. Adicione 100 microliters de etanol puro a 100 microliters de cada amostra média para obter uma razão de um para um na nova placa.
Usando um ilusminômetro, meça a intensidade fluorescente em uma excitação de 463 nanômetros, e uma emissão de 536 nanômetros. Para detecção intracelular de colesterol NBD, lave as células duas vezes com PBS. Adicione 100 microliters de solução de lise também a cada poço, e incubar à temperatura ambiente, enquanto treme por 25 minutos.
Depois disso, meça a intensidade do fluorescente ao ajustar o parâmetro de sensibilidade para 50 no software. Em seguida, determine a taxa de colesterol efflux na medida final do efflux de colesterol, conforme descrito no protocolo de texto. Diluir o colesterol NBD no etanol puro produz os valores de intensidade fluorescentes mais elevados, enquanto um alto teor em solução aquosa, reduz a intensidade.
Isso sugere que a emissão fluorescente desta molécula é altamente dependente do meio, no qual está contida. Ao usar uma mistura de mídia e etanol em uma proporção de um para um, a intensidade fluorescente parece aumentar proporcionalmente, com uma concentração do análogo do colesterol, sugerindo que a sonda está se comportando adequadamente nessas condições. Para determinar a quantidade de tempo necessária para incubar as células carregadas com aceitadores de colesterol, a mídia celular é colhida em diferentes pontos de tempo.
O efflux de colesterol evoluiu linearmente de zero a seis horas, com o sinal máximo sendo capturado seis horas após abds ser adicionado às células. O limiar de saturação e o alcance dinâmico são testados medindo o efflux de colesterol em diferentes porcentagens de HDL contendo mídia. No ativo de alta produtividade, o efflux evolui linearmente de um a 7% ABDS, atingindo o pico da capacidade de colesterol efflux em 7%Em concentrações superiores a 7% a intensidade fluroescente diminui em uma relação inversa com o percentual ABDS.
O desempenho do método baseado em fluorescência é então avaliado comparando-o com a técnica padrão de rádio rotulada. Ambas as técnicas são altamente correlacionadas quando se utiliza diferentes concentrações de ABDS. O método descrito é sensível a um aumento das concentrações de aceitadores dentro dos valores de colesterol efflux entre cinco e 15% É importante garantir que o adega não contenha agregados.
Ponto crítico é classificar um ambiente agregado de etanol contendo, para medir a fluorescência em um peso homogêneo e ótimo. Após este procedimento, o nome do colesterol técnico pode ser medido, e o efeito de drogas na via efflux de colesterol pode ser determinado. Além disso, a escola eventualmente é usada como diagnóstico para auses risco cardiovascular.
Acreditamos que este método é muito mais fácil e seguro do que o método padrão radioativo. No entanto, ainda é dependente de células. Lembre-se que o etanol é inflamável e deve ser armazenado e manuseado em conformidade.
