Este protocolo permite a modulação simultânea de muitos micro RNAs em células eucarióticas e é baseado em um método muito simples e flexível que minimiza etapas de clonagem molecular. Essa técnica tem implicações para o estudo de interações funcionais micro RNA in vitro, mas o mais importante é fornecer uma plataforma para um uso mais eficaz de micro RNAs na terapia. Desenvolvemos e usamos principalmente no contexto do câncer cerebral, mas se aplica a quaisquer doenças onde múltiplas alterações de expressão genética estejam envolvidas.
Testamos nossos genes trans artificiais em outros modelos, como linhas de câncer de mama e tireoide, mostrando a reprodutibilidade dessa técnica. O conhecimento básico da bioinformática e da biologia micro RNA é útil para este protocolo, mas não indispensável. Uma abordagem bioinformática é importante para definir combinações relevantes de micro RNA e o TRK-11, enquanto a familiaridade com o processamento de micro RNA é importante para entender como esses diferentes micro RNAs podem ser montados em clusters de DNA artificiais que podem ser processados com sucesso uma vez estáveis para as células específicas.
Para revestir o prato, primeiro dissolva a poli-D-lysina na água a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Despeje a solução no prato na quantidade de um mililitro de solução por 25 centímetros quadrados de superfície. Gire o prato para ter certeza da cobertura de todo o prato.
Após seis horas aspirar a solução de poli-D-lysine e enxaguar duas vezes com PBS. Placa células-tronco neurais humanas na quantidade de 100.000 células por cinco mililitros do meio, seja no meio celular-tronco, meio de diferenciação astróctica ou meio de diferenciação neuronal. Após o revestimento celular, coloque o prato em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma semana e prossiga para realizar a análise de expressão de micro RNA de acordo com o manuscrito.
Para cultivar células-tronco gbm-34 glioblastoma, comece com uma vezes dez para a quinta células e cinco mililitros de meio neurobásal em um frasco de 25 centímetros quadrados de baixa fixação. Coloque o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 48 horas após o revestimento, adicione concentrações duplicadas de temozolomida agente de dna a cada sete dias.
Comece com a adição de cinco micromolar TMZ suplementados em cinco mililitros médios por cinco dias. Após cinco dias, remova o meio e substitua por meio fresco sem temozolomida para permitir que as células sobreviventes se recuperem. Após 48 horas, adicione 10 temozolomida micromolar e incubar por mais cinco dias.
Repita o tratamento de temozolomida duplicada até que a concentração de pelo menos 100 micromolars seja alcançada e as células se tornem resistentes à droga. Após a indução da resistência, ficam as células usando 1 mililitro do reagente lysis. Extrair RNA total e analisar a expressão dos micro RNAs específicos de acordo com o manuscrito.
Para obter o targetome previsto de cada micro RNA previamente definido, use ferramentas de previsão de segmentação micro RNA. Na primeira página do TargetScan, selecione o micro RNA de interesse do menu suspenso pré-preenchido. Clique no botão enviar.
Baixe a lista de destinos resultantes como uma planilha usando o link da tabela de download. Para diminuir as chances de falsas previsões positivas, incluem apenas alvos dentro da coluna de sites conservados e análise a jusante. Programas adicionais de previsão de micro RNA obtém mais stringency e incluem apenas alvos que são comuns a todos os algoritmos.
Em seguida, abra a suíte ToppGene 20. Para avaliar o enriquecimento de caminhos comuns a cada micro RNA, cole a lista de metas obtidas na janela de conjuntos genéticos de treinamento. Clique no Símbolo HGNC como o tipo de entrada.
Clique em enviar e iniciar. O programa fornece uma tabela de saída mostrando as categorias go mais significativas para a lista de genes inscritos. Para finalmente estabelecer a contribuição de cada micro RNA para a regulação de um caminho comum ou processo celular, abra a função venn-diagrama fornecida no site bioinformática e genômica evolutiva.
Verifique cada targetome obtido contra a lista completa de genes envolvidos no processo celular específico. Se o mensageiro-alvo RNAs para cada micro RNAs de interesse estiverem nas respectivas janelas, faça upload da cópia-cola da lista. Nomeie cada lista com um identificador único.
Clique em enviar. O programa fornece uma saída visual de um diagrama de venn com números de genes em cada setor, bem como uma lista completa de RNAs mensageiros para cada subconjunto e combinações de intersecção. Para agrupar os micro RNAs selecionados em um gene trans funcional, obtenha um andaime transgênico baseado no lócus de cluster miR-17-92.
Obtenha a sequência de nucleotídeos do navegador genoma conjunto. Selecione a sequência de núcleo de par de aproximadamente 800 bases abrangendo todos os seis grampos micro RNA codificados do lócus e pelo menos 200 sequências de flanco nucleotídeos tanto rio acima quanto a jusante da sequência do núcleo. Cole a sequência em qualquer programa de edição de palavras.
Defina a sequência de cada um dos seis pinos de cabelo nativos recuperando-os na base miR. Marque cada uma dessas sequências dentro do período da sequência do núcleo previamente identificada. Quaisquer sequências entre cada grampo de cabelo representam sequências espaçadoras.
Em seguida, obtenha as sequências de pinos de cabelo de micro RNAs destinadas a ser mais expressas no gene trans da base miR. Observe cuidadosamente os nucleotídeos específicos que estão nos locais do decote do micro processador. Exclua as sequências nativas da sequência do núcleo, com exceção de três a cinco nucleotídeos nas extremidades cinco e em cada grampo de cabelo que servirão como um aceitador para os novos grampos.
Cole as sequências de grampos dos micro RNAs desejados para substituir os grampos de cabelo previamente excluídos. Adicione sequências de restrição desejadas em ambas as regiões de flanqueamento do gene trans para facilitar a sub clonagem em vetores de entrega de escolha. Verifique se as sequências de restrição escolhidas não estão presentes dentro da sequência em si.
Para verificar a estrutura bidimensional do gene trans, copie toda a sequência transgênica no programa de previsão de estrutura RNA RNA Webfold. Selecione as configurações padrão do programa e clique em prosseguir. Analise a saída gráfica, particularmente para a presença de grampos bem definidos na presença de estruturas de haste duplas encalhadas que são pelo menos 11 nucleotídeos proximais para o local do decote do micro processador.
Além disso, procure a ausência de pontos de ramificação dentro das sequências de grampos. Neste ponto, o gene trans está pronto para ser produzido pela síntese genética e clonado nos vetores de entrega desejados. Este método permitiu a caracterização de um módulo de três micro RNAs que são consistentemente para baixo regulados em tumores cerebrais, que são co-expressos especificamente durante a diferenciação neuronal.
Padrões de co-expressão de módulos micro RNA durante o estresse genoxico foram confirmados e sugeriram uma forte atividade sinérgica entre esses três micro RNAs. O gene trans projetado poderia simultaneamente recapitular a expressão dos três micro RNAs em células de glioblastoma, tanto in vitro quanto in vivo, com interferência significativa na biologia tumoral e aplicabilidade translacional promissora. Além disso, o cluster transgênico também foi funcional em um modelo de câncer de mama.
Os requisitos cruciais deste protocolo são manter o tamanho original do decote do processador no gene trans. E certifique-se de que a estrutura do laço de haste dos grampos quiméricos micro RNA seja preservada. Com este método, podemos concentrar múltiplos genes micro RNA biologicamente ativos em sequências de DNA muito curtas que podem literalmente ser encaixadas em qualquer vetor de entrega para uso de terapia genética.
Este método é ideal para estudar a interação funcional entre diferentes micro RNAs e interferir em complexas vias celulares multifatoriais que de outra forma exigirão múltiplas combinações de medicamentos.
