Este es un protocolo para el aislamiento de células madre musculares de ratón primario para el estudio del metabolismo ex vivo. Este protocolo proporciona una población mucho mayor de células madre en comparación con otros protocolos que hemos probado en el pasado. Y lo que es más importante, una vez que diferenciamos estas células madre en miotubos, exhiben fisiología normal, así como cosas como los ritmos circadianos.
Al probar este procedimiento por primera vez, tome notas detalladas y guarde varias imágenes porque cada tejido explant se ve diferente y habrá variación en el crecimiento de los mióblastos. Sin demostración visual, es difícil saber si estás aislando las células correctas. Nos beneficiamos de la generosa ayuda de otras personas que nos mostraron este método cuando lo establecimos en nuestro laboratorio.
Después de preparar el plato para la disección de acuerdo con el manuscrito, prepare una cámara húmeda colocando de dos a tres hojas de papel absorbente grueso en una bolsa de plástico y use una pipeta para mojar la superficie del papel con agua estéril. Coloque la cámara debajo de la luz UV durante cinco minutos para esterilizar. Diseccione el músculo deseado de un ratón de cuatro a ocho semanas de edad y enjuague suavemente en PBS que contiene 40 microgramos por mililitro de gentamicina para esterilizar.
Utilice fórceps estériles para transferir el músculo a una placa estéril de Petri no recubierta de 10 centímetros. Añadir 0,5 a un mililitro de medios de chapado sobre el músculo de modo que el tejido esté húmedo pero no flotante. Usa un bisturí estéril o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente el músculo en pequeños fragmentos.
Utilice fórceps o una pipeta para transferir los fragmentos musculares a la superficie de una placa pre-recubierta de seis centímetros. Superponga muy suavemente 0,8 mililitros de medios de chapado sobre el tejido. Coloque el plato de seis centímetros que contiene los fragmentos musculares dentro de la cámara húmeda y devuélvalo a una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
Preparar y precalentar medios de mioblast, trippsina y PBS-gentamicina en un baño de agua a 37 grados centígrados. Para recubrir un matraz T25 para cada grupo muscular, agregue dos mililitros de solución de recubrimiento a la superficie del matraz, agite suavemente para crear una capa uniforme en la superficie e incubar el matraz a cuatro grados Centígrados durante una hora. Ahora con una pipeta, retire el medio de chapado de los explantes musculares y enjuague suavemente los explantes musculares con dos mililitros de PBS-gentamicina.
Retire rápidamente el PBS y no deje que la placa se siente en el PBS. A continuación, agregue suavemente un mililitro de PBS-gentamicina y coloque la placa en la incubadora de 37 grados Celsius durante un minuto. Utilice una pipeta P1000 para recoger el PBS con células en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.
A continuación, agregue un mililitro de tripsina al plato y devuélvalo a la incubadora de 37 grados Celsius durante tres minutos. Toque suavemente las placas para desalojar los mioblastos. Recoja la tripina con las células y combínela con la colección PBS.
Agregue ocho mililitros de medios de mioblast al tubo centrífugo e invierta suavemente para mezclar. Superponga suavemente dos mililitros de solución de chapado en las placas musculares y devuelva las placas a la incubadora de 37 grados Celsius. Gire los tubos centrífugos que contienen células en una centrífuga durante tres minutos a 200 veces g.
Aspirar el sobrenadante y mantener aproximadamente un mililitro en el tubo. Agregue suavemente medios de mioblasto, transfiera las células al matraz pre-recubierto y coloque el matraz en la incubadora de 37 grados Celsius. Aspirar los medios de los matraces P0 myoblast T25.
Enjuague brevemente las células con dos mililitros de PBS-gentamicina caliente y luego aspire el PBS del matraz. Pipetear dos mililitros de PBS caliente en cada matraz que contiene mioblastos. Coloque los matraces con PBS en la incubadora de 37 grados Celsius durante tres minutos.
A continuación, toque firmemente el lado del matraz para desalojar las células. Compruebe bajo un microscopio de luz si hay mioblastos flotantes. Coloque los matraces en posición vertical en una capucha de cultivo de tejido y enjuague la parte inferior de los matraces con 10 mililitros de medios de mioblasto de dos a tres veces para asegurarse de que todas las células estén desalojadas.
Recoger la mezcla de medios celulares en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar durante tres minutos a 200 veces g. Aspirar el medio para dejar alrededor de un mililitro en el tubo teniendo cuidado de evitar el pellet celular.
Agregue suavemente un volumen adecuado de medios de mioblast al tubo centrífugo y mezcle suavemente. Distribuya la mezcla celular a los nuevos matraces T75 de seis mililitros cada uno. Agregue 10 mililitros de medios de mioblast a cada nuevo matraz T75.
Agitar suavemente los matraces horizontalmente para distribuir las células y colocarlas en la incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. En este protocolo, las células primarias surgieron de los explantes se observaron bajo un microscopio de luz estándar. Las primeras cosechas de mioblastos aparecieron como pequeñas esferas redondas y brillantes.
La diferenciación de los mioblastos tomó de cuatro a seis días durante los cuales la morfología de las células cambió de esferas redondas únicas a fibras multinómodas largas fusionadas alargadas. Se producieron miotubos totalmente diferenciados que estaban listos para medir las tasas de consumo de oxígeno. Estas células se pueden utilizar para un número de aplicaciones descendentes.
Por ejemplo, con frecuencia los utilizamos para estudiar el flujo de sustrato en instrumentos de caballitos de mar.
