이것은 신진 대사 ex vivo의 연구를 위한 1 차적인 마우스 근육 줄기 세포의 격리를 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 우리가 과거에 시도한 그밖 프로토콜에 비교된 줄기 세포의 훨씬 더 큰 인구를 제공합니다. 그리고 중요한 것은, 일단 우리가 myotubes로 이 줄기 세포를 분화하면, 그(것)들은 일반적인 생리학을 전시합니다, 그래서 circadian 리듬 같이 것.
처음으로이 절차를 시도 할 때, 상세한 메모를하고 모든 조직 explant가 다르게 보이고 myoblasts의 파생에 변화가있을 것이기 때문에 여러 이미지를 저장합니다. 시각적 데모없이 올바른 셀을 격리하고 있는지 알기가 어렵습니다. 우리는 실험실에서 이 방법을 보여 준 다른 사람들의 관대 한 도움으로부터 유익을 얻었습니다.
원고에 따라 해부 접시를 준비한 후, 두꺼운 흡수성 용지 2~3장을 비닐 봉지에 넣고 파이펫을 사용하여 종이 표면을 멸균물로 적재하여 습한 챔버를 준비합니다. 챔버를 UV 광 아래에 5분간 놓고 멸균합니다. 4~8주 된 마우스에서 원하는 근육을 해부하고 PBS에서 밀리리터 젠타마이신 당 40 마이크로그램을 함유하여 살균합니다.
멸균 집게를 사용하여 근육을 10센티미터 비코팅 페트리 접시로 옮기하십시오. 조직이 촉촉하지만 부동하지 않도록 근육에 도금 매체의 1 밀리리터에 0.5를 추가합니다. 멸균 메스 나 면도날을 사용하여 근육을 작은 조각으로 부드럽게 자릅니다.
집게 나 파이펫을 사용하여 근육 조각을 미리 코팅 된 6 센티미터 플레이트의 표면으로 옮기. 매우 부드럽게 조직에 도금 매체의 추가 0.8 밀리리터를 오버레이. 습한 챔버 내부에 근육 파편이 들어 있는 6센티미터 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 48시간 동안 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
섭씨 37도의 수조에서 myoblast 미디어, 트립신 및 PBS-gentamycin을 준비하고 예동하십시오. 각 근육 그룹에 대한 T25 플라스크를 코팅하려면 플라스크 표면에 코팅 용액 2 밀리리터를 추가하고 부드럽게 흔들어 표면에 균일한 코트를 만들고 플라스크를 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 이제 파이펫으로, 근육 이에서 도금 매체를 제거하고 부드럽게 PBS -gentamycin의 두 밀리리터와 근육 이출을 헹구십시오.
PBS를 신속하게 제거하고 플레이트가 PBS에 앉지 못하게 합니다. 그런 다음 PBS-gentamycin의 밀리리터 1 밀리리터를 부드럽게 넣고 1 분 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 놓습니다. P1000 파이펫을 사용하여 세포가 있는 PBS를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 수집합니다.
다음으로, 접시에 트립신 1 밀리리터를 넣고 3분 동안 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 접시를 부드럽게 눌러 myoblasts를 빼냅니다. 트립신을 셀과 수집하고 PBS 컬렉션과 결합합니다.
심근 세포 의 8 밀리리터를 원심분리기 튜브에 넣고 부드럽게 섞어 주세요. 근육 판에 도금 용액 2 밀리리터를 부드럽게 오버레이하고 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 원심분리기에서 세포를 포함하는 원심분리기 튜브를 200배 g에서 3분간 회전시합니다.
슈퍼 나티퍼를 흡인하고 튜브에 약 1 밀리리터를 유지하십시오. 밀라스트 미디어를 부드럽게 추가하고, 세포를 미리 코팅된 플라스크로 옮기고 플라스크를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. P0 myoblast T25 플라스크에서 미디어를 흡인.
따뜻한 PBS-gentamycin의 2 밀리리터로 세포를 잠시 헹구고 플라스크에서 PBS를 흡인시합니다. 피펫 2 밀리리터의 따뜻한 PBS는 myoblasts를 포함하는 각 플라스크에 넣습니다. PBS로 플라스크를 섭씨 37도 인큐베이터에 3분간 넣습니다.
그런 다음 플라스크의 측면을 단단히 탭하여 세포를 빼내세요. 자유롭게 떠있는 myoblasts에 대한 가벼운 현미경에서 확인합니다. 플라스크를 조직 배양 후드에 똑바로 놓고 모든 세포가 빠지도록 2~3회 미오블라스트 배지의 10밀리리터로 플라스크 바닥을 헹구는다.
15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 세포 미디어 혼합물을 수집합니다. 원심 분리기는 200배 g에서 3분간. 세포를 피하기 위해 조심되는 튜브에 약 1 밀리리터를 남기는 매체를 흡인.
원심분리기 튜브에 적절한 양의 myoblast 미디어를 부드럽게 추가하고 부드럽게 섞습니다. 새로운 T75 플라스크에 세포 혼합물을 각각 6 밀리리터에 분배한다. 각 새로운 T75 플라스크에 myoblast 미디어의 10 밀리리터를 추가합니다.
플라스크를 수평으로 부드럽게 흔들어 세포를 분배하고 하룻밤 사이에 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 이 프로토콜에서, 1차 세포는 표준 광 현미경하에서 관찰된 이분야에서 나왔다. 근사의 초기 수확은 작은 둥글고 밝은 구체로 나타났다.
근막의 분화는 세포의 형태가 단일 둥근 구체에서 긴 융합 된 긴 융합 된 긴 융합 된 다중 핵 섬유로 변경되는 동안 4 6 일이 걸렸습니다. 완전히 분화된 근투는 산소 소비율을 측정할 준비가 되어 있었습니다. 이러한 셀은 여러 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
예를 들어, 우리는 자주 해마 악기에서 기판 플럭스를 연구하는 데 사용합니다.
