Desenvolvemos um novo método para gravar sinal neural extracelular do cérebro de peixes nadando livremente. Isso abre a porta para estudar os mecanismos dos neurônios no final do dia o comportamento dos peixes. Este método é válido e à prova de água e, portanto, permite o registro enquanto os peixes nadam livremente no reservatório de água.
Além disso, o local de gravação pode ser controlado pela unidade micro incorporada. Tal Zoor-Novoplansky, nosso técnico de laboratório, vai me ajudar a demonstrar este procedimento. Para construir a carcaça, utilize uma placa de latão com dimensões de 19 milímetros por 29 milímetros por milímetro.
Com duas fendas de 5,5 milímetros nas laterais longas, perpendiculares à borda. As fendas devem estar a 6,5 milímetros de distância do lado estreito. Usando alicates, dobre a área entre as fendas nos lados longos para dentro.
Em seguida, dobre a parte inferior para dentro e para fora para obter a carcaça. Em seguida, use um bit dill de três milímetros para fazer furos na caixa de micro acionamento para os parafusos e soldar as laterais da carcaça. Use um arquivo circular fino para criar uma pequena fenda semi circular na parte inferior da carcaça que tenha um raio de 1,5 milímetros.
Usando uma broca de um milímetro faça um furo na parte de trás da carcaça para os tetrodes. Primeiro, use um cortador para quebrar uma peça de três pinos de uma única linha de cabeçalho masculino. Usando alicate puxe o pino do meio.
Em seguida, use um cortador para cortar os pinos restantes para 10 milímetros de comprimento. Use uma broca número 65 para fazer um furo através do orifício do pino médio e use um toque duplo zero 99 para perfurar um fio. Monte a micro unidade e as placas de latão.
Insira um parafuso através da primeira placa de latão, através da rosca de cabeçalho do pino e, em seguida, através da segunda placa de latão. Por fim, coloque uma porca no parafuso e aperte suavemente a micro unidade montada. Soldar os pinos junto com as placas de latão e soldar a porca junto com a ponta do parafuso.
Depois disso, solde a micro unidade na carcaça da micro unidade em quatro pontos nas laterais das placas de latão da micro unidade. Usando cola epóxi um tubo de aço inoxidável de seis milímetros de comprimento para a pequena fenda semi circular na parte inferior da carcaça da micro unidade. Cole um tubo de aço inoxidável de três milímetros de comprimento na cabeça do pino para que ele seja alinhado com o tubo de seis milímetros de comprimento na carcaça.
Insira os tubos de silicone e poliimida preparados nos dois tubos de aço inoxidável e use cola cianoacrilato para cole-os ao tubo de roubo inoxidável ligado ao cabeçalho do pino. Em seguida, dane-se a micro unidade todo o caminho para cima e cortar o excesso de tubos da parte superior e inferior dos dois tubos de aço. Em seguida, corte dois fios de prata nus com um diâmetro de 75 micrômetros a um comprimento de 12 centímetros e solde-os tanto para a conexão do solo na placa de interface eletrodo e para todos os canais nãousados.
Empurre um dos fios de tungstênio preparados em um dos orifícios de uma placa de interface de eletrodo de 16 canais. Coloque um pino no orifício e pressione-o com um alicate. Meça a resistência entre o pino e o lado não codificado do fio para verificar se há conectividade.
Repita este processo para todos os fios preparados, incluindo um fio de 50 micrômetros para eletrodo de referência. Em seguida, agrupar os fios de eletrodo em dois grupos de quatro fios cada e amarrá-los juntos usando fita adesiva na extremidade de cada fio deixando o fio de referência sozinho. Segure a placa de interface de eletrodo acima de um dispositivo de giro motorizado e coloque a extremidade da fita adesiva de um grupo de quatro fios no dispositivo.
Aplique 130 rodadas no sentido horário seguidas por 20 rotações no sentido anti-horário. Em seguida, aplique cola cianoacrilato para cobrir o tetrodo. Depois que a cola for curada, corte o tetrodo perto da fita adesiva.
Repita este processo de rotação, colagem e corte para o outro tetrode. Primeiro, conecte a carcaça do micro drive à caixa de logger com parafusos de dois milímetros. Enfie os tetrodes e o eletrodo de referência através do orifício na parte de trás da carcaça da micro unidade.
Enfie os tetrodes através dos dois tubos de silicone e rosque o fio de tungstênio de 50 micrômetros através do tubo de poliimida. Enrosque o micro mergulho todo o caminho para baixo e aplique cola cianoacrilato na parte superior dos tubos para colar os tetrodes e fios em seus tubos e garantir que o movimento seja consistente com a micro unidade. Dane-se a micro unidade até o topo.
Aplique petróleo macio no tetrodo exposto e fios dentro da carcaça da micro unidade para evitar o movimento. Conecte uma janela inferior da placa de petri pré-cortada na frente da carcaça da micro unidade com epóxi, certificando-se de manter os fios do chão fora da janela. Em seguida, aplique o revestimento vulcanizador da temperatura ambiente aos tetrodes e fios expostos entre a tampa da caixa de logger e a carcaça do microdrive.
Use uma tesoura afiada para cortar os tetrodes e o fio de referência ao comprimento desejado. Depois disso, conecte a espuma de poliestireno exalado à caixa. Ajuste seu tamanho para que sua flutuação seja equilibrada quando submersa no banho de água.
Depois de anestesiar o peixe, tire o peixe da água e coloque-o no suporte. Use uma espátula estéril para aplicar 5% de pasta de lidocaína na pele acima do local de cirurgia designado por 10 minutos. Em seguida, remova a lidocaína.
Use um bisturi de lâmina estéril 15 para remover a pele acima do crânio na região designada para o implante. Em seguida, use uma broca dentária com brocas de 0,7 milímetros para fazer quatro furos no crânio. Aplique cola cianoacrilato em um dos orifícios e insira imediatamente um parafuso de um milímetro.
Repita este processo para os furos restantes. Depois disso, use um queimador dentário para aplicar cimento dental nos parafusos e na periferia do crânio exposto. Usando a broca dentária faça um buraco de cinco milímetros de diâmetro acima da região do cérebro de interesse.
Use pinças finas e papel de tecido mole para remover tecido gorduroso entre o crânio e o cérebro e expor o alvo da região cerebral tendo o cuidado de não danificar os vasos sanguíneos grandes sob o crânio. Primeiro, abaixe o implante de tal forma que os eletrodos sejam inseridos no cérebro enquanto a parte inferior da carcaça do micro drive está perto do crânio. Comece a anexar o implante ao crânio aplicando uma pequena quantidade de cimento dental entre a carcaça e o parafuso do crânio mais próximo.
Após a primeira parte do cimento dental ser curado aplique cimento dentário adição e feche o orifício acima do crânio e todo o crânio exposto. Depois de lavar as brânquias do peixe com água doce para acordá-lo, retire o peixe do suporte e coloque-o de volta em seu tanque de origem. Certifique-se de que o peixe é capaz de nadar livremente com o implante.
O objetivo desses experimentos é estudar como a atividade neural de células únicas codifica o comportamento do peixe. Para conseguir isso, uma matriz de tetrode é implantada no telencephalon de peixes dourados que permitem que a atividade neural seja registrada. A atividade cerebral ao ser gravada é digitalizada em 31.250 Hertz e passe alto filtrado a 300 Hertz pelo garimpeiro.
Em seguida, um filtro de passe de proibição é aplicado aos sinais e os dados brutos presos são separados no canal de cada tetrode e no canal de referência. Os próximos algoritmos comuns de classificação de picos são usados para caracterizar a atividade de célula única. Primeiro, cada canal é filtrado manualmente pelo limiar mínimo de amplitude de pico.
Picos que apareceram em mais de um tetrode ou no canal de referência também são filtrados. Os espinhos detectados são então agrupados manualmente e filtrados por forma, comprimento, intervalo interpesado e análise de componentes de princípio. É importante verificar a integridade do implante antes da cirurgia.
O tetrode pode ser verificado usando um medidor de impedância padrão e a caixa deve ser verificada quanto ao vazamento debaixo d'água. Este método pode ser modificado para trabalhar com muitos animais aquáticos, desde que sejam grandes o suficiente para manter o sistema. Isso permite estudar o mecanismo neural que está por trás de seu comportamento.
