自由に泳ぐ魚の脳から細胞外神経信号を記録する新しい方法を開発しました。これは、一日の終わりに魚の行動のニューロンのメカニズムを研究するための扉を開きます.この方法は有効で、防水性があるため、魚が水槽内を自由に泳いでいる間に記録することができます。
また、記録場所はマイクロドライブで造られるによって制御することができる。私たちのラボ技術者であるTal Zoor-Novoplanskyは、この手順をデモンストレーションするのに役立ちます。ハウジングを構築するには、19ミリメートル×29ミリメートル×1ミリメートルの寸法の真鍮プレートを使用してください。
長い側面に2つの5.5ミリメートルのスリット、端に垂直。スリットは狭い側から6.5ミリメートル離れている必要があります。ペンチを使用して、長い側面のスリットの間の領域を内側に折ります。
次に、下部部分を内側に折り、上側を外側に折り、ハウジングを得ます。次に、3ミリメートルのディルビットを使用して、ネジ用のマイクロドライブハウジングに穴を開け、ハウジングの側面をはんだ付けします。細かい円形のファイルを使用して、半径 1.5 ミリメートルのハウジングの下部に小さな半円形スリットを作成します。
1ミリメートルのドリルビットを使用すると、テトロードのハウジングの背面に穴が開きます。まず、カッターを使用して、単一の行の男性ピンヘッダーストリップから3つのピンピースを分解します。ペンチを使用すると、中央のピンが引き出されます。
次に、カッターを使用して残りのピンを10ミリメートルの長さにカットします。数字65ドリルビットを使用して中央のピン穴に穴を開け、ダブルゼロ99タップを使用してスレッドをドリルします。マイクロドライブと真鍮プレートを組み立てます。
最初の真鍮プレートを通して、ピンヘッダースレッドを通して、2番目の真鍮プレートを通してネジを挿入します。最後に、ネジにナットを置き、組み立てたマイクロドライブを軽く締めます。真鍮プレートと一緒にピンをはんだ、ネジの先端と一緒にナットをはんだ。
この後、マイクロドライブはマイクロドライブの真鍮板の側面の4点のマイクロドライブハウジングにはんだ付けする。エポキシ接着剤6ミリメートル長いステンレス鋼管をマイクロドライブハウジングの底にある小さな半円形のスリットに使用する。長さ3ミリのステンレスチューブをピンヘッドに接着して、ハウジングの長さ6ミリメートルのチューブに並びます。
2つのステンレス鋼管に準備されたシリコーンおよびポリイミド管を挿入し、シアノクリレート接着剤を使用して、ピンヘッダーに取り付けられたステンレススチールチューブに接着します。その後、マイクロドライブをずっとねじ込み、2つの鋼管の上部と下部から余分なチューブを切り落とします。次に、直径75マイクロメートルのベアシルバーワイヤーを12センチメートルの長さに2本切断し、電極インターフェースボードのグランド接続と未使用のすべてのチャンネルに両方をはんだします。
準備したタングステン線の1つを16チャンネル電極インターフェースボードの穴の1つに押し込みます。穴にピンを入れ、ペンチのペアでそれを押します。ピンと配線の符号なし側の間の抵抗を測定して、接続性を確認します。
参照電極用の50マイクロメートルワイヤを含む、準備されたワイヤすべてに対してこのプロセスを繰り返します。次に、電極ワイヤをそれぞれ4つのワイヤーから成る2つのグループにグループ化し、参照ワイヤを単独で残す各配線の端にあるダクトテープを使用してテープを貼ります。電動回転装置の上に電極インターフェースボードを持ち、デバイス上の4本のワイヤの1つのグループからダクトテープの端部を置きます。
時計回りに 130 ラウンドを適用し、その後に 20 回時計回りに回転します。その後、シアノアクリル酸接着剤を塗布してテトロードを覆います。接着剤が硬化したら、管テープの近くにテトロードをカットします。
この回転、接着、切断を他のテトロードに繰り返します。まず、マイクロドライブハウジングを2ミリメートルのネジでロガーボックスに取り付けます。テトロードと参照電極をマイクロドライブハウジングの背面にある穴に通します。
テトロードを2本のシリコンチューブに通し、ポリイミドチューブを通して50マイクロメートルタングステンワイヤーを通します。マイクロダイブをずっと下にねじ込み、シアノアクリル酸接着剤をチューブの上部に塗布してテトロードとワイヤーをチューブに接着し、動きがマイクロドライブと一致していることを確認します。マイクロドライブを上までねじ込みます。
動きを防ぐために、露出したテトロードとマイクロドライブハウジング内のワイヤーに柔らかい石油を適用します。プレカットシャーレボトムウィンドウをエポキシでマイクロドライブハウジングの前面に取り付け、アースワイヤーを窓の外に置きます。次に、ロガーボックスカバーとマイクロドライブハウジングの間の露出テトロデおよびワイヤに室温加硫コーティングを適用する。
鋭利なはさみを使用してテトローデと参照ワイヤを所望の長さに切断します。この後、ボックスにマークされた、滲出ポリスチレンフォームを取り付けます。水浴に沈んだときに浮力がバランスが取れたりするように、そのサイズを調整します。
魚を麻酔した後、魚を水から取り出し、ホルダーに入れます。滅菌ヘラを使用して、指定された手術部位の上の皮膚に5%のリドカインペーストを10分間塗布する。その後、リドカインを取り除く。
無菌番号15刃メスを使用して、インプラント用に指定された領域の頭蓋骨の上の皮膚を取り除きます。その後、0.7ミリメートルのドリルビットを備えた歯科ドリルを使用して、頭蓋骨に4つの穴を開けます。穴の1つにシアノアクリル酸接着剤を塗布し、すぐに1ミリメートルのネジを挿入します。
残りのドリル穴に対してこのプロセスを繰り返します。この後、歯科用バーニッシャーを使用して、ネジと露出した頭蓋骨の周囲に歯科用セメントを塗布します。歯科ドリルを使用して、関心のある脳領域の上に直径5ミリメートルの穴を作ります。
頭蓋骨と脳の間の脂肪組織を除去し、頭蓋骨の下の大きな血管を損傷しないように注意して脳領域ターゲットを露出させるために細かいピンセットと柔らかいティッシュペーパーを使用してください。まず、マイクロドライブハウジングの下部が頭蓋骨の近くにある間に電極が脳に挿入されるようにインプラントを下げる。ハウジングと最も近い頭蓋骨ねじの間に少量の歯科用セメントを塗布することによって、インプラントを頭蓋骨に取り付け始めます。
歯科用セメントの最初の部分が硬化した後、追加の歯科用セメントを適用し、頭蓋骨と全体の露出した頭蓋骨の上の穴を閉じます。魚のエラを新鮮な水で洗い流して目を覚ました後、ホルダーから魚を取り出し、ホームタンクに戻します。魚がインプラントで自由に泳ぐことができることを確認してください。
これらの実験の目的は、単一細胞の神経活動が魚の行動をどのようにコードするかを研究することです。これを達成するために、テトロードアレイは、神経活動を記録することを可能にする自由に泳ぐ金魚のテレンスファルンに埋め込まれる。記録されている間の脳活動は、データロガーによって300ヘルツでフィルタリングされた31、250ヘルツとハイパスでデジタル化されます。
次に、オフラインで禁止パスフィルタが信号に適用され、事前にソートされた生データが各テトロードのチャンネルとリファレンスチャンネルに分けられます。次に一般的なスパイクソートアルゴリズムを使用して、単一セルのアクティビティを特徴付けます。まず、各チャンネルは最小のスパイク振幅しきい値で手動でフィルタリングされます。
複数のテトロードまたは参照チャネルに出現したスパイクもフィルタリングされます。検出されたスパイクは、形状、長さ、スパイク間間隔、および原則成分分析によって手動でクラスター化され、フィルタリングされます。手術前にインプラントの完全性を確認することが重要です。
テトロードは、標準的なインピーダンスメーターを使用してチェックすることができ、ボックスは水中で漏出をチェックする必要があります。この方法は、システムを保持するのに十分な大きさであれば、多くの水生動物と一緒に動作するように変更することができます。これにより、その行動の根本となる神経機構を研究することができます。
