Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per registrare il segnale neurale extracellulare dal cervello dei pesci che nuotano liberamente. Questo apre la porta allo studio dei meccanismi neuronali al comportamento dei pesci di fine giornata. Questo metodo è valido e impermeabile e quindi consente la registrazione mentre i pesci nuotano liberamente nel serbatoio dell'acqua.
Inoltre, la posizione di registrazione può essere controllata dalla micro unità integrata. Tal Zoor-Novoplansky, il nostro tecnico di laboratorio, mi aiuterà a dimostrare questa procedura. Per costruire l'alloggiamento, utilizzare una piastra di ottone con dimensioni di 19 millimetri per 29 millimetri per un millimetro.
Con due fessure da 5,5 millimetri sui lati lunghi, perpendicolari al bordo. Le fessure dovrebbero essere a 6,5 millimetri di distanza dal lato stretto. Usando le pinze, piegare l'area tra le fessure sui lati lunghi verso l'interno.
Quindi piegare la parte inferiore verso l'interno e il lato superiore verso l'esterno per ottenere l'alloggiamento. Successivamente, utilizzare un bit di aneto di tre millimetri per fare fori nell'alloggiamento del micro azionamento per le viti e saldare i lati dell'alloggiamento. Utilizzare un file circolare fine per creare una piccola fessura semicircolare nella parte inferiore dell'alloggiamento con un raggio di 1,5 millimetri.
Utilizzando una punta di perforazione di un millimetro fare un foro nella parte posteriore dell'alloggiamento per i tetrodi. Per prima cosa, utilizzare una fresa per interrompere un pezzo a tre pin da una singola striscia di intestazione del perno maschio. Usando le pinze estrarre il perno centrale.
Quindi, utilizzare una fresa per tagliare i perni rimanenti a 10 millimetri di lunghezza. Utilizzate una punta di perforazione numero 65 per praticare un foro attraverso il foro del perno centrale e utilizzate un doppio rubinetto zero 99 per praticare un filo. Assemblare il micro azionamento e le piastre in ottone.
Inserire una vite attraverso la prima piastra in ottone, attraverso il filo di testata del perno e quindi attraverso la seconda piastra in ottone. Infine, posizionare un dado sulla vite e stringere delicatamente il micro azionamento assemblato. Saldare i perni insieme alle piastre in ottone e saldare il dado insieme alla punta della vite.
Successivamente, saldare il micro azionamento nell'alloggiamento del micro azionamento in quattro punti sui lati delle piastre in ottone a micro azionamento. Utilizzando colla epossidica un tubo di acciaio inossidabile lungo sei millimetri alla piccola fessura semicircolare nella parte inferiore dell'alloggiamento del micro azionamento. Incollare un tubo di acciaio inossidabile lungo tre millimetri alla testa del perno in modo che sia allineato con il tubo lungo sei millimetri sull'alloggiamento.
Inserire i tubi preparati in silicone e poliimmide nei due tubi in acciaio inossidabile e utilizzare la colla cianoacrilato per incollarli al tubo di furto inossidabile attaccato alla testata del perno. Quindi, avvitare il micro azionamento fino in alto e tagliare i tubi in eccesso dalla parte superiore e inferiore dei due tubi d'acciaio. Successivamente, tagliare due fili d'argento nudi con un diametro di 75 micrometri a una lunghezza di 12 centimetri e saldarli sia alla connessione a terra nella scheda di interfaccia dell'elettrodo che a tutti i canali inutilizzati.
Spingere uno dei fili di tungsteno preparati in uno dei fori di una scheda di interfaccia per elettrodi a 16 canali. Posizionare un perno nel foro e premerlo con un paio di pinze. Misurare la resistenza tra il perno e il lato non codificato del filo per verificare la connettività.
Ripetere questo processo per tutti i fili preparati, incluso un filo da 50 micrometri per l'elettrodo di riferimento. Quindi raggruppare i fili degli elettrodi in due gruppi di quattro fili ciascuno e rastrerli insieme usando il nastro adesivo all'estremità di ogni filo lasciando il solo filo di riferimento. Tenere la scheda di interfaccia dell'elettrodo sopra un dispositivo di tornitura motorizzato e posizionare l'estremità del nastro del condotto da un gruppo di quattro fili sul dispositivo.
Applicare 130 giri in senso orario seguiti da 20 rotazioni in senso antiorario. Quindi, applicare la colla cianoacrilato per coprire il tetrodo. Dopo che la colla si è polimerizzo, tagliare il tetrodo vicino al nastro adesivo.
Ripetere questo processo di rotazione, incollaggio e taglio all'altro tetrodo. In primo luogo, collegare l'alloggiamento del micro azionamento alla scatola del logger con due viti millimetri. Infilare i tetrodi e l'elettrodo di riferimento attraverso il foro sul retro dell'alloggiamento del micro azionamento.
Infilare i tetrodi attraverso i due tubi in silicone e infilare il filo di tungsteno da 50 micrometri attraverso il tubo di poliimmide. Avvitare la micro immersione fino in fondo e applicare la colla cianoacrilato sulla parte superiore dei tubi per incollare i tetrodi e i fili ai loro tubi e garantire che il movimento sia coerente con il micro azionamento. Avvitare il micro azionamento fino in cima.
Applicare petrolio morbido sul tetrodo esposto e sui fili all'interno dell'alloggiamento del micro azionamento per evitare il movimento. Attaccare una finestra inferiore della piastra di petri pretagliata alla parte anteriore dell'alloggiamento del micro azionamento con epossidica, assicurandosi di tenere i fili di terra fuori dalla finestra. Successivamente, applicare il rivestimento vulcanizzante a temperatura ambiente ai tetrodi e ai fili esposti tra il coperchio della scatola del taglialegna e l'alloggiamento del microdrive.
Utilizzare forbici affilate per tagliare i tetrodi e il filo di riferimento alla lunghezza desiderata. Dopo questo attaccare la schiuma di polistirolo marcata e trasuda alla scatola. Regola le sue dimensioni in modo che la sua galleggiabilità sia bilanciata quando è sommersa nel bagno d'acqua.
Dopo aver anestetizzato il pesce, togliere il pesce dall'acqua e posizionare nel supporto. Utilizzare una spatola sterile per applicare la pasta di lidocaina al cinque per cento sulla pelle sopra il sito di intervento chirurgico designato per 10 minuti. Quindi rimuovere la lidocaina.
Utilizzare un bisturi sterile numero 15 per rimuovere la pelle sopra il cranio nella regione designata per l'impianto. Quindi utilizzare un trapano dentale con punte da 0,7 millimetri per praticare quattro fori nel cranio. Applicare la colla cianoacrilato su uno dei fori e inserire immediatamente una vite di un millimetro.
Ripetete questo processo per i fori di perforazione rimanenti. Successivamente, utilizzare un brunitore dentale per applicare cemento dentale sulle viti e alla periferia del cranio esposto. Usando il trapano dentale fare un foro che ha un diametro di cinque millimetri sopra la regione cerebrale di interesse.
Usa pinzette fini e carta dei tessuti molli per rimuovere il tessuto adiposo tra il cranio e il cervello ed esporre il bersaglio della regione cerebrale facendo attenzione a non danneggiare i grandi vasi sanguigni sotto il cranio. In primo luogo, abbassare l'impianto in modo che gli elettrodi siano inseriti nel cervello mentre la parte inferiore dell'alloggiamento del micro azionamento è vicino al cranio. Inizia ad attaccare l'impianto al cranio applicando una piccola quantità di cemento dentale tra l'alloggiamento e la vite cranica più vicina.
Dopo che la prima parte del cemento dentale è stata polimeri, applicare il cemento dentale additiva e chiudere il foro sopra il cranio e l'intero cranio esposto. Dopo aver lavato le branchie del pesce con acqua dolce per svegliarlo, rimuovere il pesce dal supporto e riposizionare di nuovo nel serbatoio di casa. Assicurati che il pesce sia in grado di nuotare liberamente con l'impianto.
L'obiettivo di questi esperimenti è studiare come l'attività neurale delle singole cellule codifica il comportamento del pesce. Per raggiungere questo obiettivo un array di tetrodi viene impiantato nel telencefalo del pesce rosso che nuota liberamente che consente di registrare l'attività neurale. L'attività cerebrale durante la registrazione viene digitalizzata a 31.250 Hertz e il passaggio alto filtrato a 300 Hertz dal data logger.
Quindi offline viene applicato un filtro pass ban ai segnali e i dati grezzi presorted vengono separati nel canale di ogni tetrodo e nel canale di riferimento. I successivi algoritmi comuni di ordinamento dei picchi vengono utilizzati per caratterizzare l'attività a cella singola. Innanzitutto ogni canale viene filtrato manualmente in base alla soglia minima di ampiezza del picco.
Vengono filtrati anche i picchi che sono apparsi in più di un tetrodo o nel canale di riferimento. I picchi rilevati vengono quindi raggruppati manualmente e filtrati in base alla forma, alla lunghezza, all'intervallo inter-spike e all'analisi dei componenti principali. È importante controllare l'integrità dell'impianto prima dell'intervento chirurgico.
Il tetrodo può essere controllato utilizzando un misuratore di impedenza standard e la scatola deve essere controllata per verificare la presenza di perdite sott'acqua. Questo metodo può essere modificato per funzionare con molti animali acquatici purché siano abbastanza grandi da contenere il sistema. Ciò consente di studiare il meccanismo neurale che è alla base del loro comportamento.
