Este protocolo pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre heterogeneidade e propriedades funcionais de células epiteliais amnióticas humanas isoladas da membrana amniótica. Enquanto protocolos anteriores isolaram células da membrana co-amniótica sem discernir entre as regiões, nosso protocolo permite a cultura da população celular isolada de três regiões anatômicas distintas. Para separar a membrana amniótica por região, em um armário de biossegurança em condições estéreis, identificar o amnion umbilical envolvendo o cordão umbilical, o amnão placentário que cobre o decidua basalis, e a região refletida, que é considerada o resto do amnion que não está ligado à placenta.
Para dissecar a região de amnion umbilical, utilize fórceps dissecando para segurar a porção da membrana de amnion que cobre a junção da placenta e do cordão umbilical, e use um bisturi para dissecar a região que circunda o cordão, enquanto se alonga para separar a região do acorde. Em seguida, deposite o tecido separado em um béquer rotulado com 100 mililitros de solução salina. Para dissecar a região de amnion placentária, use uma gaze de algodão estéril para remover os coágulos sanguíneos da superfície do acorde/amnion que cobre a placenta.
E usar fórceps dissecando para agarrar a membrana na fronteira entre a placenta e a região refletida. Use um bisturi para cortar ao longo da circunferência da placenta e separar o amônio placentário do acorde, tomando cuidado para não cortar nenhum vaso da placenta. Coloque o tecido separado em outro béquer rotulado com 300 mililitros de solução salina.
E separe o resto da membrana amniótica que não está ligada à placenta do acorde. Em seguida, coloque a região refletida em outro béquer rotulado com 300 mililitros de solução salina. Para lavar as membranas, use pinças para colocá-las em uma superfície estéril para poder descartar a solução salina de cada recipiente de tecido.
Coloque as membranas de volta no recipiente e adicione 100 mililitros de solução salina fresca à região umbilical e 300 mililitros de solução salina fresca para as regiões placentárias e refletidas. Use fórceps dissecando para agitar as membranas para remover qualquer resíduo sanguíneo e colocar as membranas na superfície estéril para poder descartar as soluções salinas. Em seguida, lave as membranas pelo menos mais duas vezes, como apenas demonstrado, até que os tecidos sejam translúcidos.
Para digestão enzimática das diferentes regiões de membrana amniótica, corte as regiões refletidas e placentárias em dois ou três fragmentos. E coloque os fragmentos e a região umbilical em tubos de centrífuga individuais de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de 0,5% trypsin-EDTA a cada tubo de fragmentos de tecido refletido e placentário da região e cinco mililitros de 0,5% trypsin-EDTA ao tubo contendo o tecido da região umbilical.
Agite os tubos suavemente por 30 segundos. Em seguida, coloque as membranas em uma superfície estéril, descartando a solução trypsin-EDTA e substitua-as por 30 mililitros de 0,5% de trippsina-EDTA fresca para os fragmentos de tecido refletido e placentário da região e 15 mililitros de 0,5% trypsin-EDTA frescos para o tecido da região umbilical. Em seguida, coloque os tubos em uma rotadora dentro de uma incubadora para uma rotação de 40 minutos a 20 rotações por minuto a 37 graus Celsius.
No final da incubação, transfira todo o volume da solução celular para novos tubos cônicos. E adicione duas vezes o volume de células AE humanas de 37 graus Celsius médias a cada tubo no gelo. Digerir quaisquer fragmentos de tecido remanescentes nos tubos originais com 0,5% de trippsina-EDTA fresco, como apenas demonstrado.
No final da segunda digestão, use um par de fórceps dissecando para segurar uma extremidade da porção de amnion e um segundo par de fórceps dissecando para espremer ao longo do tecido restante para remover quaisquer fileiras de células epiteliais que não se descascaram completamente durante os períodos anteriores de incubação. Em seguida, remova as membranas para poder transferir a segunda solução de digestão para um segundo conjunto de tubos de centrífuga. E inativar as enzimas de digestão com duas vezes o volume de uma célula humana AE de 37 graus Celsius no gelo.
Para o isolamento das células AE humanas, sedimentar as células por centrifugação. E resuspenque a pelota em cada tubo com 10 mililitros de um meio de célula AE humano fresco de 37 graus Celsius. Puxe cada par de digestões em um único tubo e filtre as suspensões através de filtros de 100 micrômetros para remover quaisquer detritos de matriz extracelular.
Após a contagem, semeou as células AE humanas de cada uma das três regiões em placas individuais de 100 milímetros a três vezes 10 para as quatro células por cento centímetros de concentração ao quadrado em 37 graus Celsius humanos AE cell medium, complementado com 10 nanogramas por mililitro do fator de crescimento epidérmico humano. Em seguida, incubar as culturas a 37 graus Celsius sob condições normóxidas em uma incubadora umidificada até a análise a jusante do interesse. Após 48 horas de cultura, células humanas de EA com um fenótipo epitelial aderem à superfície da placa, enquanto o supernaspeso contém detritos celulares e células flutuantes que podem ser removidos assim que o meio é alterado.
É aconselhável descartar as culturas e processar outra membrana ao identificar a presença de contaminação bacteriana, eritrócitos excessivos devido à lavagem insuficiente das membranas, células deficientes ou não aadeentes, ou células com morfologia fibroblasto. A morfologia das células AE humanas depende da origem das células, pois as células da zona refletida demonstram uma morfologia cuboidal e crescem em uma monocamada de paralelepípedos, e as células das regiões placentárias e umbilicais são mais planas e escamosas. A imunofluorescência contra a e-cadherina revela que as culturas primárias e subculturas mantêm seu fenótipo epitelial, sugerindo que não há contaminação de outro tipo de célula.
Além disso, as células são viáveis, como evidenciado por sua expressão do marcador de proliferação Ki-67. Embora as subpopulações da amnion diferem em sua morfologia e função, a expressão e presença do núcleo dos fatores pluripotência não muda nas células AE humanas derivadas das regiões placentárias e refletidas. Uma vez que as células epiteliais amnióticas humanas são uma possível fonte de células-tronco pluripotentes, podemos desafiá-las através de uma linha de protocolos de definição específicos para elucidar se essas células de cada região têm potenciais diferentes.
Antes de um protocolo iniciado, revise o histórico médico do paciente para ter certeza de que o tecido não apresenta características microbiológicas de infecção.
