Este método pode ser usado para analisar espécies de oxigênio reativa celular em células aderentes com apenas um microscópio de fluorescência, e quantificar a intensidade das espécies de oxigênio reativa com leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico. Comece semeando duas vezes 10 para o quinto HCT116 células cancerígenas colorretais em DMEM em cada poço de uma placa de 24 poços.
Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua o meio de cultura por 100 sulfato ferroso micromolar, ou 10 micromolars contendo doxorubicina, e incubar a placa por mais 24 horas. Prepare a solução DCFH-DA dissolvendo 4,85 miligramas de DCFH-DA em um mililitro de DMSO para fazer uma solução de estoque de 10 mililitros.
Logo antes de adicioná-lo aos poços, diluir o estoque com DMEM pré-aquecido para fazer uma solução de trabalho de 10 micromolar, e vórtice por 10 segundos. Para colorir as células, remova o meio contendo drogas e lave-as uma vez com DMEM. Adicione 500 microliters de solução de trabalho DCFH-DA em cada poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Após a incubação, remova o DCFH-DA dos poços e lave-os duas vezes com DMEM e uma vez com PBS. Em seguida, adicione 500 microliters de PBS a cada poço. Use o canal de proteína fluorescente verde no microscópio de fluorescência para tirar imagens representativas das células.
Em seguida, remova o PBS e adicione 200 microliters de tampão de ensaio radioimune a cada poço. Incubar a placa no gelo por cinco minutos, e coletar os lises celulares em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos a 21, 130 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, transfira 100 microliters do supernante para uma placa preta de 96 poços. Use um leitor de microplaca em um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros, e um comprimento de onda de emissão de 530 nanômetros, para medir a fluorescência em cada poço. Em seguida, meça a concentração de proteína com o ensaio de Bradford transferindo um microliter do supernante para uma placa clara de 96 poços com 100 microliters de solução de ensaio proteico.
Use as concentrações proteicas para normalizar as intensidades de fluorescência. As células cancerígenas colorretais HCT116 foram tratadas com 100 sulfato ferroso micromolar, ou 10 doxorubicina micromolar, para induzir o estresse oxidativo. Como esperado, a fluorescência verde foi dramaticamente aumentada por ambos os tratamentos.
Para quantificar as alterações relativas de intensidade, as células foram lístidas e normalizadas com concentrações proteicas. A intensidade relativa da fluorescência foi significativamente aumentada por sulfato ferroso ou doxorubicina. Ao realizar este procedimento, é importante tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, bem como minimizar a perturbação do estado celular e realizar uma extensa lavagem de PBS logo antes de tirar a imagem.
Além da detecção do ROS total por este protocolo, especificamente ros como peróxido pode ser realizado.
