Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do metabolismo, como, como a atividade metabólica é alterada durante o processo de envelhecimento. A principal vantagem dessa técnica é o uso de um segmento corporal intacto que possui dados que se assemelham muito ao estado natural e fisiológico em comparação com o isolamento mitocondrial clássico. Demonstrando o procedimento serão Anuroop e Annika, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório.
Para iniciar o protocolo, ligue a máquina uma hora antes de iniciar o experimento para que haja tempo adequado para atingir a temperatura desejada e permanecer estável. Em seguida, na configuração do software, sob o modo de administração, escolha o comprimento da calibração do cartucho e a temperatura desejada. Em seguida, digite o seguinte protocolo:Dependendo do design experimental, adicione passos de injeção das portas A a D após uma etapa de medição escolhida.
Para verificar a qualidade e a determinação do OCR basal, ajuste o protocolo para pelo menos três ciclos de medição antes de definir a injeção da primeira droga via porta A.Pré-calibrar o cartucho um dia, ou pelo menos quatro horas antes do teste, adicionando 1,0 mililitros de calibrante a cada poço, e coloque o cartucho do sensor na parte superior da placa. Cubra o cartucho com Parafilm se for programado para hidratar por mais de 24 horas para evitar a evaporação. Armazene o cartucho a 37 graus Celsius sem CO2, durante a noite.
Em seguida, certifique-se de que as drogas experimentais sejam completamente dissolvidas em meio fresco, além de 2,5% de glicose. Meça e ajuste o pH da solução de droga para o pH do veículo na temperatura desejada. Pipeta a solução de droga em sua porta de injeção alocada.
Em seguida, carregue o cartucho na máquina e comece a calibrar. Ajuste a mídia recém-preparada mais 2,5% de glicose ao pH desejado com um HCl normal. Em seguida, prepare uma caixa de gelo e coloque uma placa de metal no gelo.
Abra o pacote da placa de ilhó. Mergulhe as redes na mídia por placa de Petri de 16 milímetros. Colete uma rede com o inserdor e tenha o inserção em pé ao lado do microscópio.
Adicione uma pequena gota de mídia à rede anexada ao insertor. Em seguida, anestesiar as moscas colocando-as em uma placa de metal gelada. Usando fórceps, pegue o abdômen de uma mosca e mergulhe-o na mídia em uma placa de Petri sob o microscópio.
Usando um segundo par de fórceps, remova suavemente a cabeça da mosca. Coloque a cabeça no meio da rede presa ao inserção e verifique se a cabeça está imersa na mídia. Remova o fluido supérfluo antes de centralizar as cabeças para evitar perder cabeças enquanto as coloca no poço.
Quando houver 16 cabeças na rede, central as centralizar. Usando o inserção, coloque a rede no poço. Certifique-se de que as cabeças estão presas sob a rede e adicione lentamente 700 microliters de mídia mais 2,5% de glicose.
Certifique-se de que os poços vazios, que são usados para fundo, também contêm uma rede com 700 microliters do buffer mais 2,5% de glicose. Verifique se há bolhas de ar sob as redes através do microscópio. Pipeta suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de um milímetro para remover quaisquer bolhas.
Mantenha as cabeças centradas para uma leitura OCR confiável. Em seguida, adicione a placa à máquina e inicie a medição. No final do protocolo, remova o cartucho.
Confirme visualmente que não há sobras visíveis nas obturações da porta. Em seguida, descarte o cartucho e a placa se as cabeças não forem usadas para extração de proteínas. Lembre-se de olhar para o oxigênio e os níveis de pH, a fim de detectar quaisquer poços anormais antes da análise.
Além disso, é importante escolher o cálculo adequado da taxa de consumo de oxigênio, com base nos níveis de oxigênio. Ao realizar o protocolo, observou-se que os níveis de oxigênio das cabeças de meia-idade caíram mais rápido do que as jovens cabeças de mosca. Quando a faixa dos níveis de oxigênio é semelhante entre as condições, é melhor usar o algoritmo AKOS para gerar automaticamente a taxa de consumo de oxigênio, ou OCR, que espelha de forma confiável as mudanças de nível de oxigênio durante uma medição entre cabeças jovens versus de meia-idade.
A adição de butirato de sódio, ou SB, um inibidor de KDAC, muda transitoriamente a dinâmica dos níveis de oxigênio. Considerando que os controles do veículo apresentam níveis constantes de oxigênio durante o primeiro e último carrapato, a adição de SB causa uma queda considerável e transitória dos níveis de oxigênio nesses carrapatos. Como o cálculo da AKOS considera todos os carrapatos e ignora um estado anoxico, ele gera um OCR enganoso, como observado nos níveis de OCR não normalizados baseados em AKOS, que mostram pouca mudança após a injeção da porta A.O algoritmo fixo, que modela mais de perto e se assemelha às alterações de nível de OCR e oxigênio, revela um aumento do OCR sobre o tratamento sb.
Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar com duas pessoas juntas, a fim de garantir um tempo relativamente curto para preparar uma única placa. Após esse procedimento, outros métodos bioquímicos, como o Western Blot e a espectrometria de massa, podem ser realizados para responder a questões relacionadas a mecanismos moleculares, por exemplo, aqueles que moderam alterações metabólicas.
