Este método pode ajudar a estudar direções de proteínas com membranas lipídicas. No nosso caso, use-o para analisar a ligação dependente de cálcio dos anexos a fosfolipídios carregados negativamente. As principais vantagens dessa técnica são que ela é livre de rótulos, sensíveis, quantitativas e que as interações podem ser observadas em tempo real.
Permitindo assim a análise direta dos resultados reais. Essa técnica também pode ser aplicada a outros sistemas, como a interação de conjuntos de micromoléculas mais complexas ou mesmo células. Use soluções lipídicas claras de cinco mililitros, conforme descrito no protocolo de texto.
Combine os lipídios dissolvidos na relação molar desejada em tubos de vidro de 10 mililitros. Evaporar os solventes orgânicos usando um fluxo seco de nitrogênio. Deixe a mistura lipídica em um sistema de liofilização de alto vácuo por três horas para remover quaisquer vestígios residuais dos solventes.
Agora, resuspense o filme lipídudo em um mililitro de tampão citrato. Incubar a suspensão lipídica a 60 graus Celsius por 30 minutos em um banho de água, vórtice vigorosamente a cada cinco minutos. Esta temperatura está em torno de 10 graus Celsius acima da temperatura de transição de fase do lipídio de fusão mais alto da mistura.
Enquanto isso, pré-aqueça a extrusora equipada com uma membrana de policarbonato de 50 nanômetros de diâmetro acima da temperatura de transição por 30 minutos. Carregue a suspensão da vesícula multilamellar na extrusora pré-aquecido. Passe suavemente a mistura 31 vezes através da membrana de policarbonato para formar pequenas vesículas unilamellar ou SUVs.
Mantenha a temperatura acima da temperatura de transição. Transfira a suspensão do SUV para um vaso de reação de plástico de dois mililitros e adicione o tampão de citrato para levar o volume final a dois mililitros. Incubar quatro sensores inseridos em um suporte de politetrafluoroetileno em uma solução de 2%SDS por pelo menos 30 minutos.
Em seguida, lave-os extensivamente com água ultra pura para remover completamente o SDS e experimentá-los usando um fluxo de argônio seco ou nitrogênio. Use um sistema de limpeza de plasma para remover completamente quaisquer contaminantes. Para isso, insira os sensores secos na câmara de limpeza de plasma, evacue a câmara e lave-a três vezes com oxigênio.
Então, ligue o limpador de plasma. Use vácuo, alta potência de radiofrequência e 10 minutos de tempo de processo. Após a limpeza, desligue a máquina e tire os sensores.
Acoplar cuidadosamente os sensores limpos de plasma nas quatro câmaras de fluxo usando pinças. Evite qualquer pressão sobre ou torção das câmaras e tubos que possam causar vazamento. Lave o sistema com tampão citrato no modo de fluxo aberto por 10 minutos.
Lance o programa. Comece a registrar quaisquer alterações na frequência e dissipação do primeiro tom fundamental e sobretons usando o software até que as linhas de base de frequência e dissipação estejam estáveis. Quando as linhas de base estiverem estáveis, aplique a suspensão do SUV no tampão citrato.
Usando um vaso de reação, remova 1,5 mililitros do volume morto e feche o sistema no modo de fluxo de loop. Regisso turno de dissipação de frequência por mais 10 minutos. Quando o SLB estiver estável, equilibre o sistema com um buffer de corrida nas concentrações de cálcio necessárias em um modo de fluxo aberto por 40 minutos.
Adicione a proteína ao tampão de corrida contendo cálcio. Realize a aplicação da proteína em um modo de fluxo de loop até que um estado estável de equilíbrio seja alcançado. Agora, dissociar a proteína amarrada por questroem íons de cálcio com cinco milimães de EGTA no buffer de corrida em modo de fluxo aberto.
Regenerar o sistema de microequilístrica com 50 mililitros de água dupla destilada em um modo de fluxo aberto contínuo. Remova os tubos do recipiente de água e deixe o sistema secar. Remova cuidadosamente o sensor de cristal e limpe-o com uma solução de 2% SDS usando o suporte de politefluoroetileno.
Seque as partes visíveis do interior do módulo de fluxo onde o sensor foi colocado. Mostrado aqui, é o registro da curva de frequência e mudanças de dissipação. A queda proeminente na frequência após a adição dos lipossomos, indica sua absorção porque as vesículas preenchidas com tampão não são rígidas, mas viscoelásticas, a dissipação aumenta.
Posteriormente, as vesículas coalescing se rompem. A liberação concomitante do tampão dentro das vesículas diminui a massa adsorvida até que um platô estável seja atingido. A ligação do Anexo A2 aos lipídios adiciona massa como visto pela clara mudança de frequência, mas não interfere na estrutura bicamada, como indicado pela única pequena mudança na dissipação.
Quando íon de cálcio é removido pelo agente quelaante, EGTA, Anexo A2 dissocia do filme lipídico. A frequência e as gravações de dissipação mudam para os níveis vistos com a bicamadas indicando apenas que a ligação Anexa a A2 é totalmente dependente do íon de cálcio e que o filme lipíduo permanece intacto. Um experimento representativo de controle negativo é mostrado aqui.
Quando a fosfatidylserina está ausente, não há alterações na frequência ou dissipação após a adição de Anexo A2 na presença do íon de cálcio. Ao tentar este procedimento, é importante garantir a formação adequada de bicamadas. Use os lipossomos imediatamente, caso contrário, as pequenas vesículas se fundirão em maiores com menos tensão superficial que pode levar a uma linha de base instável.
Após este procedimento, pode ser realizada uma descrição quântica de uma interação com proteínas de membrana para responder a perguntas adicionais como vinculação cooperativa versus não cooperativa.
