Este método pode ser útil para responder a perguntas-chave em campos de neurobiologia, como como funcionam os terminais pré-sinápticos in vivo. A principal vantagem desse conjunto de técnicas é que mostramos abordagens complementares para atar a função de caminhos olfativos usando girinos xenopus como modelo animal. Demonstrando este procedimento seremos eu, Beatrice Terni, e Paolo Pacciolla.
Inicie o procedimento de transeção, molhando duas peças de papel filtro qualitativo de celulose em solução anestésico 0,02%MS2 22, e colocando-as sob o escopo de dissecação. Em seguida, escolha um girino do tanque e mergulhe-o em um prato de solução anestéstica. O girino deve parar de nadar dentro de dois a quatro minutos.
Verifique se há anestesia adequada pela ausência de uma reação a estímulos mecânicos aplicados no nível da cauda usando pinças. Coloque o girino anestesiado no papel do filtro sob o escopo. Posicione o animal com seu lado dorsal voltado para cima para que as estruturas cerebrais possam ser visualizadas.
Para experimentos comportamentais, use tesoura veni para transectar ambos os nervos para suprimir todas as informações odórantes que chegam à lâmpada olfativa. Carregue uma pipeta de vidro poled com dois microliters de solução de dextrina verde cálcio, e coloque-a no microinjetor. Coloque um girino anestesiado sob o microscópio dissecando no papel filtro, em seguida, mova a ponta da pipeta para a cavidade principal da cápsula nasal e entregue 0,15 a 0,3 microlitros do corante.
Deixe o girino no lugar por dois a três minutos. Usando uma pipeta Pasteur, gotejamento 0,02%MS2 22 solução para as partes mais aconchegantes do animal para evitar a secagem. Transfira o animal para o tanque de recuperação onde o girino deve recuperar a natação normal dentro de 10 minutos ou mais.
Observe florescence ao nível da camada glomerular da lâmpada olfativa no dia seguinte à injeção. Prepare um girino anestesiado para imagens removendo a pele acima da lâmpada olfativa. Use uma tesoura veni para fazer uma incisão lateral na pele do girino na borda do sistema nervoso central ao nível da lâmpada olfativa.
Evite estender o corte ao tectum, que pode ser facilmente identificado pela localização do nervo óptico. Mantenha o animal úmido aplicando gotas de solução 0,02%MS2 22 usando uma pipeta Pasteur e, em seguida, belisque a pele cortada usando pinças e puxe-a sobre o sistema nervoso. Verifique a remoção bem sucedida pela ausência de melanócitos acima da lâmpada olfativa.
Coloque o girino no poço do prato revestido de guarda de célula. Posicione um deslizamento de tampa de vidro revestido com graxa de vácuo alto para cobrir a parte superior do tectum até a extremidade da cauda. Certifique-se de que a lâmpada olfativa e os placodes permaneçam expostos ao meio extracelular.
Encha o prato pitri com a solução de Xenopus Ringer contendo 100 tubocurarina micromolar para evitar contrações musculares. Coloque o prato segurando o girino sob um microscópio vertical. Conecte o reservatório contendo a solução de Xenopus Ringer com o prato usando tubos de polietileno para profusão contínua da solução de Xenopus Ringer.
Comece a perfundar a solução de Xenopus Ringer. Mantenha o nível da solução na constante prato durante todo o experimento. Avalie continuamente a viabilidade do girino observando a circulação sanguínea através dos vasos.
Comece a imagem ao vivo usando um objetivo de baixa ampliação para visualizar o girino. Mova o eixo micromanipulador para colocar o capilar entregando a solução odoante na parte superior de uma cápsula nasal, formando um ângulo de 90 graus com o nervo olfativo. Encontre a lâmpada olfativa localizada ipsilateralmente na cápsula nasal.
Mude para um objetivo de água de alta ampliação com uma longa distância de trabalho. Verificar a emissão de floresnças por estruturas i.Glomerulares deve ser óbvio. Comece por tubos de 20 mililitros de solução de aminoácido fresco em um reservatório elevado.
Em seguida, pegue seis girinos privados de alimentos de seu tanque de habitação, e coloque-os em dois litros de água de girino limpo para minimizar a exposição aos odores. Coloque um prato de seis poços modificado em um transilluminador LED branco. Encha cada poço com 10 mililitros de água girino.
Coloque um girino por poço e deixe descansar por pelo menos três minutos. Inicie a aquisição de imagens e adquira filmes que contenham períodos basais, de estímulo e de recuperação. Uma resposta atraente pode ser detectada como um movimento em direção ao bocal que fornece a solução de aminoácidos.
Devolva os animais ao tanque após a imagem. Rastrear posições da cabeça do girino dentro de uma área de 35 milímetros por 35 milímetros, ou o tamanho equivalente em pixels, permite uma análise quantitativa do comportamento guiado olfativo. A linha pontilhada representa a área proximal à entrada da solução de odor.
Parcelas individuais de movimentos de girinos são construídas usando coordenadas X Y obtidas pela análise de imagem. Os gráficos de motilidade extraídos devem reproduzir fielmente imagens de vídeo. Uma região de interesse de 8,75 milímetros de raio centrada na entrada da solução é usada para classificar a proximidade dos animais à fonte odoante.
Mais tempo gasto nas proximidades do bocal do odor indica tropismo positivo. O tempo gasto por girinos perto do bocal durante períodos definidos, por exemplo, intervalos de 15 segundos, permite identificar a capacidade de detectar soluções de aminoácidos. O comportamento geral de uma população de girinos pode ser obtido plotando a distribuição de dados individuais.
O tropismo positivo pode ser detectado quando a solução de aminoácidos é preparada a um mililitro ou 160 micromolar. Os animais não respondem à aplicação da água. Após este procedimento, outros métodos como técnicas histológicas ou eletrofisiologia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como a alteração de propriedades sinápticas após a lesão.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área da neurobiologia explorarem o processamento de informações olfativas no girino Xenopus.
