Os autores gostariam de agradecer ao Bob Freeman para treinamento e laboratório de Kirschner para a utilização do mecanismo sapo, e membros do laboratório Vactor Van de apoio. Agradecemos a Nikon Imaging Center da Harvard Medical School de assistência à microscopia de luz para as imagens na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo seguinte: NRSA NIH companheirismo e comunhão NIH K99 a LAL, Ciência Básica Parceria financiamento ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) a AEF, e NIH RO1 NS035909 para DVV

Nota: Nós descrevemos as etapas nas duas primeiras seções só em breve, como protocolos excelentes com informações detalhadas foram publicadas em outros lugares que o foco mais especificamente sobre essas etapas (por exemplo, 8-12). Além disso, o protocolo geral do trabalho com neurônios de Xenopus espinhal em cultura de células vivas foi publicado anteriormente em um artigo detalhado métodos 8. Recomendamos rever esse artigo como um complemento a este vídeo, apesar de que aqui nós não fornecer informações suficientes para executar com êxito e solucionar a dissecção tubo neural e protocolo de revestimento no passo 3. 1. Fertilização In Vitro de Xenopus Ovos <ol><li> Obter ovos de rãs do sexo feminino que foram injetados com gonadotrofina coriônica (400 unidades / sapo) 12-18 horas antes da coleta de ovos. Recolher ovos em solução 1X de Marc Ringer modificada (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM de MgSO4, 2,0 mM de CaCl 2, HEPES 5,0 mM, pH 7,4 9). </li><li> Fertilizar os ovos in vitro com testículos picada, conforme descrito anteriormente 9. </li><li> Após pelo menos 20 min, remover o revestimento de gelatina, por incubação de embriões embriões em cisteína a 2% em 1X MMR (ajustada a pH 7,8 com NaOH) durante 3-5 min. Lava-se com 0,1 X MMR (ou 0,1 x MBS (Modificado de Barth receita, Saline 1X: 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2,5 mM de NaHCO3, 5 mM de HEPES, pH 7,8)) 3 -5 vezes, e manter os embriões à temperatura ambiente até que as injecções, ou, se desejado, os embriões lugar em 14-18 ° C para retardar o desenvolvimento. </li></ol> 2. Micro-injecção de RNA Nota: quando se utiliza a injecção de RNA aqui, estas técnicas não são limitados a RNA, e DNA, as proteínas ou os ácidos nucleicos modificados para a manipulação de genes também pode ser utilizado e tem sido descrito previamente 12. <ol><li> Antes do experimento, RNAs para a rotulagem de estruturas do citoesqueleto ou outro are transcritos a partir de moldes de ADN linearizado usando a mMessage mMachine kit (Ambion). mRNAs requerem a 5 &#39;e uma tampa 3&#39; da cauda de poliadenilação para promover a translação e evitar a degradação em embriões. pCS2 + é um vector habitualmente utilizada para esse fim, e o kit de transcrição inclui um análogo de tampa durante a reacção de síntese. Nós re-suspender em ARNm transcrito sem nuclease DDH 2 0, a uma concentração de estoque entre 500 e 2.000 ng / uL, seguido de armazenagem rápida a -80 ° C. Antes da injecção, dilui-se o RNA em DDH 2 0 a uma concentração adequada para a injecção. Como apenas um pequeno volume será injectado em embriões, ressuspensão em tampão não é necessário. A concentração final de injecção é tipicamente de 50-200 pg / nl, dependendo da construção, e geralmente vai injectar-se a 4 nl por embrião, embora muitos laboratórios tradicionalmente injectar-se a 10 nl, que é aproximadamente de 1% do volume total de um embrião. RNA podem ser tóxicos em doses elevadas, e a dose por géneros embriãolly varia entre 10 pg e 1 ng, embora até 5 ng pode ser tolerada, dependendo do gene particular e da pureza. No entanto, para localização de proteínas de imagens, o nível mais baixo possível, deve ser injetada para evitar a sobre-expressão artefatos. RNA para EB1-GFP neste protocolo é usado no valor final de 250 pg por embrião. </li><li> Preparar as agulhas de injecção puxando capilar com um extractor de agulha 9, para um diâmetro da ponta de ~ 0,2 um. Com um P-87 Sutter extrator, usamos as seguintes configurações: calor 644, 125 tração, velocidade de 70, o tempo de 250, mas esses parâmetros variam dependendo da máquina e deve ser reajustado depois de mudar o filamento (que usamos atualmente de 2,5 mm filamento caixa quadrada que é de 2,5 mm de largura). Sob um microscópio, quebrar a ponta da agulha com uma pinça em um ângulo para gerar uma forma de pena-like. Existem outros métodos para quebrar e enchendo as agulhas de injecção (por exemplo, 11,12), mas a agulha de encher com RNA, colocando uma pequena gota (0,5 - 1 ml) para a extremidade traseira doagulha. Para microinjecting em embriões, há uma série de sistemas de injecção comercialmente disponíveis, duas das mais comuns são o Pico-injector (Medical Systems), e a Nanoject (Drummond Scientific) (ver 11 para mais informação). Usamos o Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, que utiliza gás comprimido, por um período definido de tempo digital, a fim de fornecer volumes nanolitros consistentes. Volume de injecção deve ser calibrado para cada micropipeta novo usando um micrómetro fase, e tempo de injecção deve ser ajustada para se obter a quantidade desejada de RNA injetadas. </li><li> Lugar embriões fertilizados no 1 - a fase de 4 células para uma placa de plástico que contém 5% de Ficoll em 0,1 X MMR. Segurando o embrião no lugar com fórceps, ou a colocação de uma plataforma de suporte (uma malha de plástico, com uma grelha de 1 mm ~, aderida ao fundo da placa com plasticina ou cera dental), injecta-se de volume desejado em blastómeros de origem animal (ver etapa 2.1 para obter detalhes sobre volumes de injecção). Distribuir em vários locções ao longo de embriões, pelo menos, uma injecção em cada um dos blastómeros de origem animal, para obter uma distribuição mais uniforme (por exemplo, para uma fase de embrião de 4 células, que normalmente injectar 1-2 vezes em cada blastômero, ao passo que numa fase de 2 células embrião, injetamos 2-4 vezes em cada blastômero). Um benefício de esperar até o estágio de célula 2-4 é que você garante o embrião começou a decompor normalmente. No entanto, se o tempo é da essência, você pode começar no estágio 1-célula, com pouca diferença no resultado final que não seja mais embriões que precisam ser injetado. Embriões mais velhos estágio pode ser utilizado também, e isso é particularmente útil, se os tipos de células específicos são dirigidos para a injecção, mas geralmente preferimos que a expressão mais amplo, é injectar nos embriões jovens para reduzir a necessidade de injecções mais numerosos. </li><li> Transferência de embriões injetados a um prato de plástico contendo 0,1 X MMR e permitir-lhes desenvolver até o estágio 20-23 13. Incubar os embriões a 14 até 22 ° C, dependendo spe desejadoed de desenvolvimento. (Para dissecar tubos neurais no dia seguinte, utilizar ~ 22 ° C. Para um dia depois, utilizar ~ 14 ° C.) </li></ol> 3. Dissecção do tubo neural e chapeamento <ol><li> Antes de realizar as dissecações, preparar os pratos da cultura 14. Em primeiro lugar, com uma solução de revestimento de lamelas suficiente de 200 ug / ml de poli-lisina em PBS a piscina sobre a superfície da lamela, de qualquer Mattek ou pratos de cultura Lab-Tek, e incuba-se durante uma hora (alternativamente, pode-se utilizar lamínulas sentados solta numa placa de Petri, para colocação posterior sobre lâminas de vidro para a imagiologia e imunocitoquímica). Aspirar e lavar com um excesso de PBS 3 vezes, e deixar secar. Em seguida, os pratos revestimento com 10 | ig / ml em PBS a laminina (geralmente usamos 500 ul por lamela, o suficiente para cima da superfície da piscina) durante uma hora a 37 graus. Aspirar solução laminina e lava-se 3 vezes com um excesso de PBS, tendo o cuidado de não deixar a laminina superfícies revestidas são expostas para a interface de ar. Substituindoe PBS com meios de cultura (50% de Ringer, 49% L-15 media, 1% de soro fetal de bovino, além de 50 ug / ml de penicilina / estreptomicina e gentamicina, pH 7,4 e esterilizado por filtração). (Media Ringer, 115 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 10 mM de Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Enquanto o nosso protocolo utiliza essa mídia, deve-se notar que este é um meio enriquecido comum para idosos Xenopus culturas ganglionares da retina, onde os neurônios têm reduzido energia reservados. Jovens culturas da medula espinhal irá sobreviver e crescer durante mais de 24 horas no Media Ringers puros, sem fatores adicionais de crescimento, e esta é certamente uma das vantagens da utilização deste sistema. Opcional: adicionar NT3 e BDNF (para concentrações finais de 25 ng / ul cada) ao meio de cultura para aumentar o crescimento axonal. </li><li> Devido à variabilidade na expressão de mRNA injectado, os embriões podem apresentar um mosaico de fluorescência. Antes de realizar dissecações, embriões de tela para a presença de fluorescência, para identificar os embriões que express da proteína de fusão fluorescente do tubo neural. Coloque embriões fluorescentes na fase 20-23 em um prato de agarose revestidas de plástico cheio com meio de Steinberg (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM de Ca (NO 3) 2, 1,3 mM de MgSO4, 4,6 mM de Tris, pH de 7,8, em seguida, autoclavado) 5. Para fazer o prato de agarose-revestido, revestimento de fundo de prato de plástico derretido com agarose 1% em 0,1 X MMR e endurecer let. Isto proporciona uma superfície macia, de modo que não ocorram danos às pinça fina e agulhas de tungsténio utilizados durante as etapas subsequentes de dissecação. Dissecação de embriões de fase para além de 23 é possível, mas é mais difícil quando os tecidos aderir mais perto uns dos outros e, portanto, necessitam de um tratamento mais prolongado com colagenase. </li><li> Sob um escopo de dissecação, remover a membrana vitelina, com uma pinça fina e, em seguida, isolar a totalidade da porção dorsal do embrião, fazendo uma série de incisões. Enquanto uma pinça de segurar o embrião no lugar, use o segundo para fazer uma incisão nalado do embrião para expor o interior oco. Em seguida, utilizar as duas pinças de beliscar ao longo do tecido entre as metades dorsal e ventral do embrião, cortando desse modo o embrião ao meio para isolar a porção dorsal que contém o tubo neural. </li><li> Colocar o explante dorsal em um tubo Eppendorf com 2 mg / ml de colagenase em meio Steinberg por 15-20 minutos num rotor, para soltar os tecidos, e, em seguida, explante dorsal pipeta numa cápsula de agarose revestidas de plástico com uma solução fresca de Steinberg. Alternativamente, o explante pode ser colocado numa placa de Petri contendo a solução de colagenase durante 15 minutos, em que a dissecção inteiro podia então ser realizada. </li><li> Utilizando um par de pinças, dissecar suavemente o tubo neural da epiderme dorsal e ventral da notocorda. Deslizar a ponta da pinça entre a epiderme e o tecido subjacente e, lentamente, puxar para trás a epiderme, revelando o tubo neural abaixo. Em seguida, utilizar uma pinça para segurar o tecido e outra para fazer deslizar a ponta entre otubo neural e notocorda. Finalmente, utilize uma pinça para remover os somitos de cada lado do tubo. </li><li> Transferir o tubo neural a um prato de agarose revestidas preenchido com meio de cultura, tal como descrito no passo 3.1. </li><li> Depois da recolha de vários tubos neurais, corte em pedaços numerosas (cerca de 20, se o tubo inteiro é isolado) utilizando agulhas de tungsténio aguçadas ou pinças, e depois as peças de chapa em placas de cultura com meio de cheias (preparada no passo 3.1), espalhando-se explantes uniformemente em linhas. </li><li> Após o plaqueamento, não mova os pratos, porque esta iria perturbar as células de fixação. Incubar os banhados explantes do tubo neural em torno de 20-22 ° C. Nós normalmente deixam o prato de células no banco à temperatura ambiente durante a noite. Uma das vantagens de Xenopus laevis neurónios é a de que uma incubadora especial para a cultura celular, que regula os níveis de CO 2 ou a temperatura não é necessário. Neurites e cones de crescimento pode ser observado e trabalhada à temperatura ambiente 12-24 Horas após o plaqueamento, embora desdobramento pode ser acelerada com a adição de factores de crescimento. Em geral, a expressão de um RNA ou produto plasmídeo irá resultar em expressão variável entre as células e, assim, pode haver um intervalo de níveis de expressão de fluorescência entre os cones de crescimento. Temos observado RNA expressão de proteínas fluorescentes para persistirem além de 48 horas após o plaqueamento, embora isto dependa da construção particular. </li></ol> 4. Resultados representativos Depois, seguindo o protocolo, o qual é resumido na Figura 1A, saudáveis, correctamente, dissecados e cultivados explantes neuronais irá enviar axônios numerosos ou neurites em todas as direcções sobre laminina / poli-lisina substrato, mostrado na Figura 1B. Os cones de crescimento nas pontas dos axônios podem ser visualizados por qualquer ótica DIC, como visto na Figura 1C, a dinâmica global da imagem de motilidade, ou de alta resolução de microscopia de fluorescência para examinar o localization de fluorescentemente marcadas com proteínas do citoesqueleto, por exemplo, EB1-GFP é mostrado na Figura 1D. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> Figura 1. Síntese de protocolo experimental e os resultados esperados. A) Protocolo de fluxograma. Veja o filme para obter detalhes sobre a dissecção no dia 3. O tubo neural inteira deve ser cortado em cerca de 20 pedaços de tamanho igual, e espalhar-se uniformemente em linhas na lamela. Neste desenho animado, tesouras são retratados para representar o corte do tecido com uma pinça fina. CG gonadotrofina coriônica B) imagem DIC de axônios ou neuritos crescem fora do explante (explante no canto superior esquerdo). C) a imagem maior aumento de cone de crescimento na ponta de um axônio em crescimento. D) a imagem de microscopia de fluorescência da GFP EB1 em cone de crescimento. Barra de escala 10 m. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Explantes de Xenopus laevis neurais enviar neurites de uma maneira muito robusta por 24 horas após o plaqueamento na laminina / poli-lisina substrato, se as condições são apropriadas. Com este substrato, cones de crescimento são altamente móveis e podem atingir comprimentos de axónios de até 1 mm, estendendo-se em todas as direcções para fora a partir do explante, embora comprimentos típicos são de 100 um ou mais. Se neurites não crescem para fora, há um número limitado de razões para que este s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Gonadotrofina Coriônica </td><td> Argent Chemical Laboratories </td><td> C-GCH-ON-10 </td></tr><tr><td> Cisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> As agulhas capilares Borosil 1,2 milímetros (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont n º 5 Biologie Inox Pinça </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Pratos Mattek </td><td> Mat Tek Corporação </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> Poli-l-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

O complexo processo de direccionamento axonal em grande medida pelo cone de crescimento, que é a estrutura dinâmica móveis na extremidade do axónio crescente. Durante o crescimento axonal, o cone de crescimento deve integrar múltiplas fontes de informação deixa de orientação para modular seu citoesqueleto, a fim de impulsionar o cone de crescimento para a frente e precisa navegar para encontrar seus alvos específicos 1. Como esta integração ocorre ao nível do citoesqueleto é ainda emergente, e exame da proteína do citoesqueleto e dinâmica efectoras dentro do cone de crescimento pode permitir a elucidação desses mecanismos. Cones de crescimento de Xenopus laevis são suficientemente grandes (10-30 microns de diâmetro), para realizar alta resolução de imagem ao vivo da dinâmica do citoesqueleto (por exemplo 2-4) e são fáceis de isolar e manipular em um ambiente de laboratório em comparação com outros vertebrados. A rã é um sistema modelo clássico para estudos de desenvolvimento da neurobiologia e importantes idéias iniciais em mic cone de crescimentodinâmica rotubule foram inicialmente encontrados usando este sistema 5-7. Neste método 8, os ovos são recolhidos e fertilizados in vitro, injectados com RNA que codifica as proteínas de fusão marcadas com fluorescência do citoesqueleto ou outras construções de manipular a expressão do gene, e depois deixou-se desenvolver até o estádio do tubo neural. Tubos neurais são isolados por dissecção e, em seguida, são cultivadas, e cones de crescimento de neurites superando são gravadas. Neste artigo, descreve-se como para executar este método, o objectivo da qual é a cultura de Xenopus laevis cones de crescimento para a análise de imagem subsequente de alta resolução. Enquanto nós fornecemos o exemplo da proteína de fusão + TIP EB1-GFP, este método pode ser aplicado a qualquer número de proteínas de elucidar o seu comportamento no interior do cone de crescimento.

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Explantes neurais de dissecados<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriões que expressam proteínas de fusão fluorescentes permite a imagiologia da dinâmica de crescimento do cone do citoesqueleto.

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

12.5K visualizações.  Harvard Medical School. Explantes neurais de dissecados Xenopus laevis Embriões que expressam proteínas de fusão fluorescentes permite a imagiologia da dinâmica de crescimento do cone do citoesqueleto.

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Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Neurociência

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultânea de pré e pós-sináptica gravação eletrofisiológico de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo músculo-Co-culturas

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...