Neste vídeo, demonstramos como expressar construções de DNA exógeno em neurônios ópticos e como imaginar arbores axonais ópticas expressivas individuais em girinos xenopus laevis intactos e vivos. Trata-se de um procedimento simples e barato para transgênese transitória específica de células que permite a determinação da função genética autônoma celular em arbores axonais ópticas individuais, desenvolvendo-se em um sistema modelo vertebrado vivo. Demonstrando o procedimento, serei eu, Sophia Dao, Assistente de Pesquisa, e a Dra.
Para começar, corte suavemente a ponta de uma pipeta micro capilar de vidro puxada com fórceps finos. Enchimento de vidro a pipeta micro capilar de vidro com óleo mineral usando um MICROFIL de tal forma que uma pequena gota de óleo mineral aparece na ponta cortada da micro pipeta. Encha a pipeta micro capilar de vidro no meio do caminho com óleo mineral.
Em um injetor, ejete o êmbolo no meio do caminho e carregue a pipeta micro capilar de vidro puxada no suporte de injeção. Em seguida, estenda o êmbolo até a extensão máxima para confirmar que a pipeta micro capilar está fortemente presa ao injetor e não se move com a extensão do êmbolo. Transfira uma gota de três microliter da mistura DNA/DOTAP em uma folha quadrada de papel parafina de uma polegada.
Sob um microscópio de dissecação estéreo, mova a ponta da pipeta micro capilar de vidro para a gota de DNA/DOTAP. Use a opção de preenchimento no aparelho de injeção, suga lentamente a gota de DNA/DOTAP na pipeta micro capilar de vidro. A fronteira entre o óleo mineral e a solução DNA/DOTAP é visível na pipeta micro capilar de vidro devido à ligeira opacidade da solução DNA/DOTAP.
Se necessário, pare de encher a pipeta micro capilar periodicamente para permitir que a pressão na pipeta micro capilar de vidro se recalibrar. Primeiro, em uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 0,1X MMR, manualmente desvitellinize 10 estágio 20 a 24 embriões xenopus com fórceps finos. Segure o envelope vitelline na cintura para evitar ferir os embriões.
Com fórceps tanto na mão esquerda quanto na direita do experimentador, estoure a bolha do envelope vitelino e solte o embrião do envelope vitelino. Tome cuidado para não ferir os embriões ao remover o envelope vitelline. Em seguida, use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta de corte para transferir de cinco a 10 estágio desvitélite 22 a 24 embriões para uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 1X MMR.
Sob um microscópio estéreo, segure um dos embriões desvitellinizados na placa de Petri com fórceps e organize o embrião para que seu polo anterior seja apontado para cima no campo de visão. Em seguida, oriente o embrião para que ele esteja deitado lateralmente e um de seus botões oculares da esquerda para a direita está voltado para cima. Segure o embrião com as fórceps na mão nondominante do experimentador e com a mão dominante do experimentador, introduza a ponta da micro pipeta de vidro do lado ventral ou dorsal logo abaixo da epiderme no botão do olho.
Injete entre 70 a 210 nanoliters da solução DNA/DOTAP. Em seguida, gire o embrião e realize a mesma micro injeção no outro olho no lado contralateral do embrião. Injete ambos os botões oculares de seis a 10 embriões em cada experimento.
Após a micro injeção, armazene embriões em uma placa de Petri com 1X MMR por aproximadamente 30 minutos para facilitar a cicatrização da ferida. Após 30 minutos, transfira os embriões injetados com uma pipeta de transferência plástica para uma solução mmr de 0,1X com fenilthiocarbamida de agente de branqueamento de 0,001% para reduzir a pigmentação. Cubra a placa de Petri com uma tampa para cultivar os embriões por aproximadamente cinco dias até que os embriões tenham se desenvolvido em girinos nos estágios 46 a 47.
Este protocolo produz uma taxa de sucesso de 30 a 60% dos embriões xenopus injetados expressando GFP em um a 10 arbores axonais ópticos. Imagens confocais representativas da GFP mostram o controle expresso e as arbores axonais ópticas mutantes nos girinos Xenopus intactos. Dois mutantes de domínio de APC, APCNTERM e APBbeta-cat foram clonados em plasmídeos pCS2.
Imagens da série Z do controle GFP e arbores axonal mutantes APC foram reconstruídas. Parcelas de número de ramos, comprimento total do ramo arbor e comprimento médio do ramo confirmam diferenças observadas entre controle e mutante APC expressando arbors axonais. Gráficos de dispersão adicionais de número de ramos versus comprimento médio do ramo com linhas de regressão mostram correlação inversa entre esses parâmetros e arbores axonais ópticas expressando domínios APC.
A ponta da pipeta micro capilar deve ser corretamente inserida superficialmente no broto ocular para que a epiderme cinza sobrevoando o broto do olho incha durante cada micro injeção. Este procedimento pode ser usado tanto para rotular e alterar a função genética específica em neurônios ópticos, enquanto avalia o crescimento, direcionamento e ramificação de axônios a partir desses neurônios ópticos. Esta microinjeção de DNA e técnica de lipofecção permitiram aos pesquisadores da neurobiologia do desenvolvimento estudar mecanismos moleculares autônomos celulares que regulam a arborização do axônio óptico em girinos xenopus laevis intactos e vivos.
