Este protocolo é significativo porque permite que os cientistas realizem uma análise genética simples da doença bacteriana do murcho no tomate. A principal vantagem dessa técnica é que a manipulação da expressão genética e dos ensaios subsequentes pode ser realizada em pouco tempo e com os pequenos requisitos de equipamentos e espaço de crescimento da planta. Este método é muito versátil, e pode ser aplicado a outras plantas agrícolas para realizar tanto a inoculação de patógenos quanto outros ensaios fisiológicos.
Para manter a esterilidade durante a manipulação das mudas in vitro, é importante manter as placas fechadas quando estiverem fora do capô de fluxo. Esta é uma técnica fácil, mas requer vários passos para manipulação. A visualização deste método ajudará a ver pequenos truques difíceis de explicar no manuscrito, ajudando outros pesquisadores a implementar o método em seus laboratórios.
Ajudando a demonstrar este procedimento será Achen Zhao, um estudante de pós-graduação. Depois de esterilizar e lavar as sementes de tomate, transfira-as para o meio Murashige e Skoog sem sacarose. Mantenha as sementes no escuro a uma temperatura entre 25 e 28 graus Celsius por três dias.
Coloque filtros de 8,5 centímetros quadrados dentro de placas de Petri de nove centímetros quadrados contendo meio-forte Murashige e Skoog médio, e coloque seis sementes de tomate germinadas em cada prato. Sele a placa com fita micropora, e incuba as sementes germinadas a 25 a 28 graus Celsius por três a quatro dias. Cultivar o Agrobacterium rizogenes MSU440 em meio LB sólido com antibióticos apropriados por dois dias a 28 graus Celsius antes da transformação da planta.
Usando um bisturi estéril, corte o radículo e o fundo do hipocótel das mudas de tomate. Use pontas plásticas ou uma lâmina de bisturi para colher biomassa A.rizogenes da superfície do meio LB, e mergulhe cuidadosamente as mudas de tomate cortadas na biomassa bacteriana. Depois disso, cubra as mudas de tomate com um papel filtro semicircular de dois centímetros por quatro centímetros, a fim de manter uma alta umidade e facilitar a sobrevivência e o desenvolvimento de novas raízes.
É importante manter as mudas em alta umidade em um ambiente que permita a transpiração. Para isso, cubra as mudas com papel filtro e feche a placa com fita micropore. Armazene as mudas de tomate transformadas por seis a sete dias em uma câmara de crescimento a uma temperatura entre 25 e 28 graus Celsius.
Em seguida, use um bisturi estéril para cortar as novas raízes peludas emergentes, e permitir que as mudas produzam novas raízes peludas. Uma vez que a segunda geração de novas raízes peludas apareça, remova o papel filtro em cima das mudas e sele novamente a placa com fita micropore. Para visualizar a fluorescência DsRed ou qualquer outro equipamento para imagem in vivo da planta, marque as raízes positivas transformadas, que podem ser identificadas pela fluorescência vermelha.
Use um bisturi para remover as raízes negativas não transformadas, que podem ser identificadas pela falta de fluorescência vermelha. Transfira as mudas que mostram fluorescência vermelha para uma nova placa contendo meio-forte Murashige e Skoog médio, a fim de facilitar o desenvolvimento da raiz transformada como a raiz principal. Mantenha as mudas que não apresentam fluorescência vermelha na mesma placa para verificar o surgimento de raízes fluorescentes em pontos de tempo posteriores.
Cubra as mudas com um papel filtro de semicirculação de dois centímetros por quatro centímetros, sele a placa e incuba as mudas para que elas desenvolvam novas raízes peludas. Prepare os potes de inoculação onde a superfície das raízes será exposta ao inóculo bacteriano, primeiro absorvendo os potes de inoculação com água, derramando qualquer excesso de água e, em seguida, colocando-os em uma bandeja de plantio de plástico. Utilizando pinças, transfira as mudas selecionadas com raízes transformadas para os potes de inoculação.
Cubra a bandeja com plástico ou uma tampa transparente, e mantenha-as a 25 a 28 graus Celsius com 65% de umidade. Remova a tampa após cinco ou seis dias. Cresça Ralstonia em cinco LB médio líquido em um agitador orbital a 28 graus Celsius, com agitação a 200 rpm, até a fase estacionária.
Meça a densidade óptica em 600 nanômetros para determinar os números bacterianos. Diluir a cultura bacteriana com água para um OD600 de 1. Coloque de 16 a 20 potes de inoculação que contenham plantas de tomate transformadas em uma bandeja de inoculação.
Em seguida, despeje 300 mililitros de inóculo bacteriano diluído na bandeja, e deixe as plantas de molho no inóculo por 20 minutos. Depois disso, prepare uma nova bandeja com uma camada de solo de vaso. Mova os potes inoculados para a nova bandeja, e coloque as bandejas em uma câmara de crescimento com 75% de umidade, uma temperatura entre 26 e 28 graus Celsius, e um fotoperóudo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.
Aqui, as raízes do tomate são transformadas e inoculadas com a Ralstonia para realizar análisegens simples para o estudo da doença bacteriana murcha. O desenvolvimento dos sintomas da doença é acompanhado em plantas de tomate com raízes transformadas com um vetor vazio e aquelas transformadas com uma construção RAI voltada para o tomate CESA6. Os dados do índice da doença são coletados da mesma unidade experimental ao longo do tempo de acordo com uma escala arbitrária de zero a quatro e não seguem uma distribuição gaussiana, excluindo o uso de testes padrão para dados paramétricos.
Como abordagem padrão, um teste U Mann-Whitney, de duas caudas, não paramétrico, para comparar as curvas de controle e infecção é usado. De acordo com esta análise, a diferença entre as medianas de ambas as curvas parece não ser significativa. Também é possível quantificar a área sob a curva de progresso da doença, o que permite combinar múltiplas observações do progresso da doença em um único valor.
A área sob a curva de progresso da doença mostra maior valor para as plantas de controle em comparação com as plantas de tomate CESA6 RNAi no final do processo de infecção, indicando que as plantas silenciadas pelo tomate CESA6 são mais resistentes à infecção por Ralstonia do que as plantas de controle. Os intervalos de confiança oferecem uma forma de estimar, com alta probabilidade, uma gama de valores em que o valor populacional de uma determinada variável é encontrado. Como visto aqui, a área do intervalo de confiança de 95% para as curvas de controle e infecção estima uma maior chance de resistência quando o CESA6 é silenciado.
Os valores do índice da doença podem ser transformados em dados binários, considerando um índice de doença inferior a dois correspondentes a zero e um índice de doença igual ou superior a dois correspondentes a um. Isso permite a representação de uma curva de sobrevivência após a inoculação de Ralstonia. As diferenças na taxa de sobrevivência entre o controle e as plantas infectadas não são estatisticamente significativas de acordo com o teste estatístico Gehan-Breslow-Wilcoxon.
A expressão do CESA6 é então analisada em duas raízes transformadas selecionadas aleatoriamente antes da etapa de inoculação, mostrando que a resistência aumentada à Ralstonia se correlaciona com a expressão reduzida do CESA6. Após duas rodadas de seleção, uma taxa de transformação de 35 a 40% pode ser obtida, e esse valor pode ser aumentado realizando rodadas de seleção adicionais. Durante a realização deste procedimento, é importante manter as mudas cobertas com um pedaço de papel filtro para manter a alta umidade e selar as placas com Micropore para garantir a troca de gás.
Após a transformação da raiz, muitos dos tratamentos podem ser aplicados para estudar a resposta vegetal por observação da fisiologia radicular ou usando biologia molecular, biologia celular ou bioquímica. Principalmente, essa técnica permitirá que pesquisadores com recursos limitados realizem análisegens genéticas de infecção bacteriana em raízes de tomate.
