Este método pode ajudar as pesquisas a encontrar rapidamente e sem esforço períodos anormais de desenvolvimento embrionário de tomate. A principal vantagem deste protocolo é o tratamento de sementes de tomate com hipoclorito de sódio que fornece uma base para a observação de embriões de tomate. Comece com a preparação química e colheita dos frutos de Solanum lycopersicum três a 23 dias após a floração ou DAF.
Coloque imediatamente os frutos no gelo e divida-os em frutos precoces, médios e tardios, com base nos dias após a floração. Quebre a fruta precoce, coloque-a em uma lâmina e colete cuidadosamente as sementes frescas com pinças de precisão sob ampliação de 1x a 4x do microscópio estéreo. Para frutos médios e tardios, quebre os frutos e colete diretamente sementes frescas usando pinça de precisão.
No método convencional, transfira as sementes recém-coletadas imediatamente para um tubo de centrífuga de dois mililitros contendo fixador FAA de 1,5 mililitros e coloque o tubo no agitador orbital a 5 rpm por quatro horas à temperatura ambiente. Em seguida, desidrate as sementes em 70%95% e 100% de etanol por uma hora cada em um agitador orbital a 5 rpm. Uma vez feito, coloque a semente nas três a cinco gotas de solução de limpeza presentes na lâmina e cubra-a suavemente com um deslizamento de cobertura.
Use uma única lâmina côncava para sementes médias e tardias. Dependendo dos estágios de desenvolvimento das sementes, incube-as à temperatura ambiente para limpeza. Após a incubação, observe as amostras com um contraste de interferência diferencial, ou microscópio DIC equipado com uma câmera digital na ampliação de 10x, 20x e 40x.
Ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture imagens. Transfira as sementes frescas coletadas dos frutos quebrados para um tubo de centrífuga de dois mililitros contendo 1,5 mililitros de solução desinfetante. Incubar as amostras num agitador orbital a 30 rpm durante três a 50 minutos à temperatura ambiente.
Uma vez que o contorno do revestimento da semente mais interno esteja claramente visível, descarte a solução desinfetante. Para sementes médias e tardias, transfira as sementes para uma lâmina. Use fórceps e uma agulha dissecante para remover a mucilagem da semente sob ampliação de 1x a 4x do microscópio estéreo.
Transfira as sementes de volta para o tubo de centrífuga original usando pinças. Lave-os cinco vezes em 1,5 mililitros de água deionizada por 10 segundos cada e descarte a água deionizada. Em seguida, adicione o volume duplo da solução de limpeza às sementes.
Dependendo do estágio da semente, dê o tratamento a vácuo intermitente por zero a 50 minutos, com intervalos de 10 minutos após cada tratamento a vácuo de 10 minutos. Após o tratamento a vácuo, substitua a solução de limpeza. Para facilitar a limpeza das sementes, coloque o tubo de centrífuga protegido da luz por 30 minutos a sete dias à temperatura ambiente.
No caso de embriões tardios, substitua a solução diariamente por uma solução de limpeza fresca, seguida de submeter as sementes a tratamento a vácuo por 10 minutos. Coloque as sementes limpas na lâmina ou na lâmina côncava única. Usando o microscópio DIC equipado com uma câmera digital, ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture a imagem.
No método convencional de limpeza de sementes de S.lycopersicum, os densos endospermas bloquearam a visualização de embriões precoces a 3 e 6 DAF. A diminuição da permeabilidade durante o crescimento das sementes resultou em imagens difusas após 9 DAF. A mucilagem e o revestimento das sementes tornaram-se gradualmente mais densos, impedindo a penetração de agentes de limpeza a partir de 13 DAF.
O contorno do embrião dentro de 14 a 19 sementes DAF foi extremamente borrado, apesar do tempo de tratamento prolongado de sete dias. A estrutura interna em 22 sementes DAF era completamente invisível. A mucilagem do revestimento da semente despojada produzida pelas células epidérmicas do revestimento da semente foi proeminente a partir de 13 DAF.
O tratamento com hipoclorito de sódio possibilitou a identificação clara do revestimento interno da semente e o descolamento da maior parte da mucilagem aderente sem danos às sementes. No protocolo de clareamento otimizado as sementes apresentaram transparência satisfatória em todas as etapas de desenvolvimento testadas. Foram observadas as distintas camadas celulares do revestimento da semente a 3 DAF, os endospermócitos distinguíveis a 5 DAF, o embrião em forma de bastão a sete DAF, o estágio globular a 9 DAF e o estágio cardíaco a 11 DAF.
No protocolo otimizado, o grau de ondulação dos cotilédones e do meristema apical da parte aérea foi muito facilmente capturado em vários estágios do desenvolvimento embrionário. A esterilização remove a mucilagem das sementes e o pigmento do revestimento das sementes, que aumentam a penetração e a visualização das sementes. O tratamento a vácuo pode acelerar a penetração da solução de limpeza.
