Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 para JE) e Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 para JE) da Espanha. A EC foi apoiada pela bolsa Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidade de Madrid e UAM).

Todos os procedimentos de criação e experimentação de camundongos devem ser conduzidos em conformidade com a legislação local, nacional, internacional e diretrizes sobre experimentação animal.
1. Indução do crescimento de pelos, indução de queimaduras e identificação de LRCs de BrdU a longo prazo no epitélio da pele da cauda íntegra
NOTA: Utilizar camundongos C57BL/6 com 10 dias ou 7 semanas de idade, preferencialmente ninhadas, para os planejamentos experimentais descritos abaixo. Em todos os procedimentos experimentais, os animais serão anestesiados por inalação de isoflurano a 3% ou eutanasiados por luxação cervical conforme indicado.
<ol><li>Indução do crescimento de pelos na pele posterior de camundongos na segunda fase telógena (repouso) (cerca de 50 dias pós-natal)<ol><li>Anestesiar camundongos com inalação de isoflurano a 3%. Confirme a anestesia profunda completa pela falta de um reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé). Faça a barba de duas regiões independentes lado a lado da pele posterior em cada mouse usando cortadores de cabelo e creme depilatório (Tabela de Materiais). Use o lado esquerdo para o controle e o lado direito para o tratamento. NOTA: Verifique se, após o barbear, a pele subjacente do dorso está rósea e não acinzentada/preta, um indicador de melanogênese e entrada na fase anágena (crescente) nesta cepa de camundongo.</li>
		<li>Lavar cuidadosamente com PBS para remover todos os restos de creme e proceder à indução da produção transitória in situ de níveis não letais de ROS, conforme descrito na secção 2.1.</li>
		<li>Registre o crescimento do folículo piloso através da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas de controle e da pele das costas tratadas em cada animal (por exemplo, usando uma câmera HD acoplada a uma lente binocular de 5 a 20x).</li>
	</ol></li>
	<li>Indução de lesões de queimadura de2º grau na pele posterior de camundongos na segunda fase telógena (repouso) (cerca de 50 dias pós-natal)<ol><li>Anestesiar camundongos. Faça a barba em toda a região da pele das costas em cada rato usando cortadores de cabelo e creme depilatório e lave bem com PBS para remover todos os restos de creme. OBS: Administrar injeções subcutâneas in situ de lidocaína a 0,5% (2 mg/ml) em soro fisiológico estéril, não excedendo 7 mg/ml, imediatamente antes do procedimento de queimadura.</li>
		<li>Pré-aqueça uma barra de latão (1 cm em secção transversal) a 95 °C imergindo em água fervente e, em seguida, aplique na região central da superfície dorsal da pele dorsal de cada rato durante 5 s.</li>
		<li>Logo após a geração da queimadura, injetar intraperitonealmente os animais com 1 mL de solução fisiológica (NaCl a 0,9%) em manta elétrica para evitar a desidratação. Deixar que os animais se recuperem durante 24 h e proceder à indução da produção transitória in situ de níveis não letais de ROS, conforme descrito no ponto 2.3.</li>
		<li>Registre a progressão da ferida por queimadura por meio da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas de pele das costas controladas e tratadas em cada animal (por exemplo, usando uma câmera HD acoplada a uma lente binocular de 5 a 20 vezes).</li>
	</ol></li>
	<li>Geração e identificação de LRCs de BrdU de longa duração no epitélio cutâneo da cauda<ol><li>Injetar ninhadas de 10/14 dias por via intraperitoneal (sem anestesia) uma vez por dia durante 4 dias consecutivos com 50 mg/kg de peso corporal BrdU dissolvido em PBS. Após a fase de marcação, permita que os ratos cresçam durante 50 a 60 dias antes de qualquer tratamento. NOTA: Use uma agulha nova para cada injeção.</li>
		<li>Proceder como descrito na secção 2.3 para a indução da produção transitória de ROS não letais in situ na pele da cauda em diferentes momentos antes da preparação de montagens inteiras de tecido.</li>
		<li>Para preparar montagens inteiras da epiderme da cauda, eutanasie camundongos por deslocamento cervical e prenda a cauda com tesoura cirúrgica.<ol><li>Use um bisturi para fazer uma incisão longitudinal reta ao longo de toda a cauda e descasque toda a pele como uma única peça da espinha dorsal. Incubar a pele descascada em EDTA 5 mM em PBS em tubos de 5 mL por 4 h a 37 °C e separar cuidadosamente as folhas intactas da epiderme da derme usando pinças.</li>
			<li>Fixar o tecido em formaldeído a 4% em PBS por pelo menos 72 h à temperatura ambiente (TR) e proceder à detecção de BrdU usando anticorpos apropriados.</li>
			<li>Utilizar fluorescência/microscopia confocal para identificar e quantificar LRCs em cada condição experimental, incluindo controles de luz e tratamentos fotodinâmicos em diferentes momentos antes da preparação dos tecidos inteiros, como descrito anteriormente em detalhes19,20. NOTA: As folhas epidérmicas fixas podem ser armazenadas em PBS contendo azida sódica a 0,02% a 4 °C por até três meses. Lâminas epidérmicas fixas podem ser usadas para imunolocalização das proteínas necessárias seguindo procedimentos de cortes histológicos padrão.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Indução da produção transitória de níveis não letais de ROS na pele de camundongos
OBS: Para induzir a produção transitória de níveis não letais de ROS na pele de camundongos, será utilizado um tratamento fotodinâmico utilizando um precursor do fotossensibilizador endógeno PpIX, no caso, metil-aminolevulinato (mALA), e luz vermelha.
<ol><li>Para activar a produção transitória de ROS para a indução do crescimento de pelos na pele posterior, prepare os animais conforme indicado no ponto 1.1.<ol><li>Aplicar ~25 mg de mALA na forma de creme tópico (Tabela de Materiais) na região direita, mantendo o lado esquerdo como controle interno evitando diferenças interindividuais. Incubar por 2,5 h no escuro, lavar bem o excesso de creme com PBS. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total. NOTA: A produção de PpIX na pele posterior deve ser testada in situ pela sua fluorescência vermelha sob excitação de luz azul (407 nm).</li>
		<li>Anestesiar os animais.</li>
		<li>Irradiar toda a pele do dorso com uma fonte de luz vermelha adequada (Tabela de Materiais) para uma dose total de 2,5−4 J/cm2. Manter os ratinhos numa manta eléctrica até à sua recuperação completa e proceder como descrito no passo 1.1.3. NOTA: A irradiância deve ser ajustada manipulando-se a distância entre a fonte de luz e o tecido e medida usando um medidor de energia de potência (Tabela de Materiais). O experimento é considerado terminado quando o crescimento total de pelos é observado em qualquer uma das regiões independentes raspadas de cada animal. Todo o procedimento envolve apenas um único tratamento fotográfico.</li>
	</ol></li>
	<li>Para ativar a produção transitória de ROS para melhorar a cicatrização de lesões de queimadura de2º grau, prepare os animais conforme indicado na seção 1.2.<ol><li>Aplicar ~25 mg de mALA na forma de creme tópico em toda a superfície queimada, abrangendo cerca de 4 mm de tecido adjacente. Incubar por 2,5 h no escuro, lavar bem o excesso de creme com PBS. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total.</li>
		<li>Anestesiar os animais.</li>
		<li>Irradiar toda a pele do dorso com uma fonte de luz vermelha adequada para uma dose total de 2,5−4 J/cm2. Manter os ratinhos sobre uma manta eléctrica até à sua recuperação completa e proceder como descrito no passo 1.2.4. OBS: O procedimento experimental para cada animal é considerado concluído quando se observa a cicatrização completa da queimadura. Todo o procedimento envolve apenas um único tratamento fotográfico.</li>
	</ol></li>
	<li>Para ativar a produção transitória de ROS na pele da cauda, prepare ratinhos conforme indicado na secção 1.3, aplique ~25 mg de mALA sob a forma de creme tópico ao longo de toda a área do tecido dorsal e proceda como descrito na secção 2.1 para a pele posterior. Realizar tratamentos fotográficos e controles de luz correspondentes 24 h, 48 h ou 72 h antes da eutanásia do animal e posterior extração de montagens inteiras da pele da cauda. NOTA: Em todos os delineamentos experimentais, testar a dependência de ROS do processo usando removedores de ROS antioxidantes (por exemplo, inoculação diária de 100 mg/kg de peso corporal de N-acetil-cisteína por injeção intraperitoneal de uma solução de 20 mg/mL em PBS, pH 7,2, começando 5 dias antes dos tratamentos com mALA ou, alternativamente, duas doses de 100 mg/mL de ácido ascórbico em etanol a 50%, espaçado 30 min, aplicado topicamente sobre a pele no intervalo de tempo entre os tratamentos com mALA e a irradiação com luz vermelha).</li>
</ol>3. Detecção de ERO na pele
<ol><li>Avaliação ex vivo da produção de ERO na pele da cauda após tratamento fotodinâmico com hidroetidina NOTA: A hidroetidina é uma molécula não fluorescente que reage especificamente com ROS para produzir o corante fluorescente 2-hidroxietídio (hET).<ol><li>Incubar peles inteiras da cauda, obtidas como descrito no ponto 1.3.3, durante 3 h a 37 °C em EDTA 5 mM em solução PBS (amostras de controlo) ou adicionalmente contendo 2 mM mALA (amostras de tratamento fotodinâmico).</li>
		<li>Em todos os casos, adicionar hidroetidina a uma concentração final de 3,2 μM a partir de um estoque de 25 mg/mL em dimetilsulfóxido (DMSO) e incubar por 1 h no escuro em TR.</li>
		<li>Esticar as amostras de pele da cauda sobre uma superfície de vidro usando as pontas dos dedos e irradiar com luz vermelha de 636 nm a uma fluência de 10 J/cm2 .</li>
		<li>Proceder imediatamente à separação da epiderme da derme e à fixação das lâminas epidérmicas conforme descrito no ponto 1.3.3.</li>
		<li>Avalie a emissão vermelha de hET sob um microscópio de fluorescência/confocal usando luz verde excitante, capture imagens de alta qualidade e prossiga com análises adicionais. NOTA: Usar a coloração hET de amostras de tecido na ausência de tratamento fotodinâmico como um controle negativo para a auto-oxidação de hET.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção in vivo da produção de ERO na pele posterior após indução do crescimento do cabelo e cicatrização de queimaduras seguida de tratamento fotodinâmico NOTA: Esta etapa é realizada usando diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DHF-DA), um composto não fluorescente persignificado celular que, após clivagem por enzimas esterases intracelulares, reage especificamente com ROS dando o corante fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF).<ol><li>Utilizar animais preparados para a indução do crescimento de pelos (secção 1.1) ou para a cicatrização de queimaduras (secção 1.2). Imediatamente antes dos tratamentos tópicos com creme de mALA (ver secções 2.1 e 2.2), dispense topicamente 100 μL de 1 mg/ml em etanol a 50% de DHF-DA em todas as áreas de pele alvo de controlo/tratadas, deixe a pele absorver totalmente o material e prossiga com a aplicação tópica de creme de mALA.</li>
		<li>Incubar os animais tratados durante 4 h no escuro, lavar bem o creme mALA tópico da pele com PBS e dispensar uma segunda dose de 100 μL de solução de DHF-DA na pele. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total.</li>
		<li>Incubar os animais tratados por 50 min no escuro, anestesiar e irradiar toda a pele do dorso com uma fluência variando de 2,5 a 4 J/cm2 de luz vermelha de 636 nm usando uma lâmpada LED.</li>
		<li>Imediatamente após a irradiação, avaliar os níveis de ROS gerados na pele usando um sistema de imagem in vivo (Tabela de Materiais). Ajuste a caixa de filtro para excitação de 445−490 nm e emissão de 515−575 nm, capture imagens de alta qualidade e prossiga com análises adicionais. NOTA: Utilizar a coloração DHF-DA de amostras de tecido na ausência de tratamento fotodinâmico como controle negativo para a auto-oxidação de DHF-DA.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Bl&#225;zquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+1O2+optical+excitation:+A+tool+for+redox+biology.">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li><li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease.">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li><li>Sena, L. A., Chandel, N. 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L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases.">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez-Garc&#237;a, D., Wood, C. D., Castro-Obreg&#243;n, S., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+A+radical+role+in+development.">Reactive oxygen species: A radical role in development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).</li><li>Covarrubias, L., Hern&#225;ndez-Garc&#237;a, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obreg&#243;n, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+Passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development:+Regulation+and+responses.">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li><li>Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+prime+Drosophila+haematopoietic+progenitors+for+differentiation.">Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation.</a> Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-Dependant+Manner.">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Hamanaka, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species+Promote+Epidermal+Differentiation+and+Hair+Follicle+Development.">Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development.</a> Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).</li><li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing.">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li><li>Carrasco, E., Bl&#225;zquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, &. #. 1. 9. 3. ;., Espada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+on+a+transient+endogenous+ROS+production+in+mammalian+cells+and+tissues.">Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues.</a> Methods. , 109 (2016).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Hsu, Y. -. C., Li, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+interactions+between+skin+stem+cells+and+their+niches.">Emerging interactions between skin stem cells and their niches.</a> Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).</li><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells+and+implications+for+wound+repair.">Epithelial stem cells and implications for wound repair.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).</li></ol>

Todas as aplicações comerciais dos procedimentos descritos neste trabalho estão protegidas por uma patente CSIC-UAM (EP2932967A1) de autoria da EC, MIC e JE e licenciada à Derma Innovate SL para exploração comercial. JE e JJM têm uma posição consultiva na Derma Innovate SL.

Aqui, apresentamos uma metodologia que permite uma ativação transitória da produção endógena de ERO in vivo em pele de camundongo com efeitos fisiológicos. A metodologia baseia-se em um procedimento fotodinâmico para induzir uma estimulação local e controlada do fotossensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Esta abordagem experimental é uma ferramenta interessante para estudar a biologia de ROS em sistemas experimentais in vivo, constituindo um avanço significativo sobre metodo...

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são o resultado da redução química do oxigênio molecular para formar água, e incluem o oxigênio singlete, o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila 1,2,3. As ROS têm uma vida útil muito curta devido à sua natureza extremamente química reativa. Em organismos aeróbios, as ERO são formadas incidentalmente no interior das células como um importante subproduto da respiração aeróbica (cadeia de transporte de elétrons) nas mitocôndrias. O acúmulo transitório de altos níveis de ERO na célula resulta em uma condição de estresse oxidativo que pode provocar a inativação irreversível de proteínas, lipídios e açúcares e a introdução de mutações na molécula de DNA 2,3,4,5. O acúmulo gradual de dano oxidativo em células, tecidos e organismos inteiros aumenta progressivamente com o tempo e tem sido associado à indução de programas de morte celular, diversas patologias e ao processo de envelhecimento 2,3,4,6.
Os organismos aeróbios têm desenvolvido constantemente mecanismos moleculares eficientes para combater o acúmulo excessivo de ERO em células e tecidos. Esses mecanismos incluem membros da família de proteínas superóxido dismutase (SOD), que catalisam a dismutação do radical superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio, bem como diferentes catalases e peroxidases que utilizam o pool antioxidante (glutationa, NADPH, peroxirredoxina, tiorredoxina 7,8) para catalisar a subsequente conversão de peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular.
No entanto, vários relatos suportam o papel das ROS como componentes-chave de circuitos moleculares que regulam funções celulares críticas, incluindo proliferação, diferenciação emobilidade2,3,4. Esse conceito é ainda apoiado pela identificação e caracterização inicial de mecanismos dedicados produtores de ERO em organismos aeróbios, incluindo lipoxigenases ciclooxigenases e NADPH oxidases 9,10. Nesse sentido, as ERO exibem um papel ativo durante o desenvolvimento embrionário de vertebrados 11,12,13 e papéis fundamentais para essas moléculas na regulação de funções fisiológicas específicas in vivo têm sido relatados em diferentes sistemas experimentais, incluindo o programa de diferenciação de progenitores hematopoéticos em Drosophila14, indução de cura em zebrafish ou regeneração da cauda em girinos de Xenopus 15. Em mamíferos, as ROS têm sido envolvidas no potencial de auto-renovação/diferenciação de células-tronco neurais em um modelo de neuroesfera16 e na desregulação da função das células-tronco intestinais durante o início do câncer colorretal17. Na pele, a sinalização das ERO tem sido associada à diferenciação epidérmica e à regulação do nicho de células-tronco cutâneas e do ciclo de crescimento dos folículos pilosos18,19.
Nessa perspectiva, uma grande limitação experimental para determinar os papéis fisiológicos das ROS em sistemas biológicos, tanto em condições normais quanto patológicas, é a falta de ferramentas experimentais adequadas para induzir a produção controlada dessas moléculas em células e tecidos, assemelhando-se com precisão à sua produção fisiológica como mensageiros de segunda sinalização. Atualmente, a maioria das abordagens experimentais envolve a administração de ERO exógenas, principalmente na forma de peróxido de hidrogênio. Recentemente, implementamos uma abordagem experimental para ativar uma produção in vivo transitória e não letal de ROS endógenas na pele de camundongos, baseada na administração de precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX (PpIX; por exemplo, ácido aminolaevulínico ou seu derivado metílico metilaminolevulinato) e posterior irradiação da amostra com luz vermelha para induzir a formação in situ de ROS a partir de oxigênio molecular intracelular (Figura 1). Esse procedimento fotodinâmico pode ser eficientemente utilizado para estimular nichos de células-tronco residentes, ativando os programas regenerativos do tecido19,20 e abrindo caminho para novas modalidades terapêuticas na medicina regenerativa da pele. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada do protocolo, mostrando exemplos representativos de estimulação de nichos de células-tronco, medida como um aumento no número de células de retenção de marcação (LRCs) de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) a longo prazo na região do abaulamento do folículo piloso19,21, e subsequente ativação de programas de regeneração (aceleração do crescimento do cabelo e processos de cicatrização de queimaduras) induzidos por produção não letal de ERO na pele da linhagem C57Bl6 de camundongos.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescin diacetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">D6883-50MG</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5&#39;-bromo-2&#39;-deoxiuridine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein</td>
			<td style="width:104px;">Roche</td>
			<td>11202693001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depilatory cream (e.g., Veet)</td>
			<td style="width:104px;">Veet</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Dihydroethidium</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2</td>
			<td style="width:104px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g</td>
			<td style="width:104px;">Galderma</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)</td>
			<td style="width:104px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp</td>
			<td style="width:104px;">Photocure ASA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stimulation of stem cell niches and tissue regeneration in mouse skin by switchable protoporphyrin ix-dependent photogeneration of reactive oxygen species in situ

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir fotogeração in vivo comutável de espécies reativas endógenas de oxigênio (ROS) em pele de camundongos. Essa produção transitória de ERO in situ ativa eficientemente a proliferação celular em nichos de células-tronco e estimula a regeneração tecidual, fortemente manifestada através da aceleração dos processos de cicatrização de queimaduras e crescimento de folículos pilosos. O protocolo é baseado em um tratamento fotodinâmico regulável que trata o tecido com precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX e irradia o tecido com luz vermelha sob parâmetros físico-químicos rigorosamente controlados. De modo geral, este protocolo constitui uma ferramenta experimental interessante para analisar a biologia das EROs.

A administração tópica do precursor mALA na pele do dorso e da cauda de camundongos resulta em acúmulo significativo de PpIX em todo o tecido e, visivelmente, no folículo piloso, como demonstrado pela fluorescência vermelho-rósea desse composto sob excitação à luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). A irradiação subsequente do tecido tratado com luz vermelha (636 nm) a uma fluência de 2,5−4 J/cm2 promove a produção transitória de ERO no tecido, particul...

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Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

stimulation-stem-cell-niches-tissue-regeneration-mouse-skin

Research

JoVE Journal

Biology

1.9K visualizações.  Ramón y Cajal University Hospital. O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Vídeo: Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Biologia

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling structure that forms rapidly post-amputation and is required for limb regeneration. However, methods to study its precise function at the molecular level over the last decades have been limited due to a paucity of precise functional techniques and genomic information available in salamander model systems. Excitingly, the recent plethora of sequencing technologies coupled with the release of various salamander genomes and the advent of functional genetic testing methods, including CRISPR, makes it possible to re-visit these foundational experiments at unprecedented molecular resolution. Here, I describe how to perform the classically developed full skin flap (FSF) surgery in adult axolotls in order to inhibit wound epidermis formation immediately following amputation. The wound epidermis normally forms via distal migration of epithelial cells in the skin proximal to the amputation plane to seal off the wound from the outside environment. The surgery entails immediately suturing full thickness skin (which includes both epidermal and dermal layers) over the amputation plane to hinder epithelial cell migration and contact with the underlying damaged mesenchymal tissues. Successful surgeries result in the inhibition of blastema formation and limb regeneration. By combining this surgery method with contemporary downstream molecular and functional analyses, researchers can begin to uncover the molecular underpinnings of wound epidermis function and biology during limb regeneration.

This article describes how to perform a surgical method to inhibit wound epidermis formation during axolotl limb regeneration by immediately suturing full thickness skin over the amputation plane. This method allows researchers to investigate the functional roles of the wound epidermis during the early stages of limb regeneration.

Inibição da Formação de Epiderme ferida através de cirurgia de retalho de pele completa durante a regeneração do membro axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.