Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 to JE) e dell'Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 to JE) della Spagna. EC è stata sostenuta dalla sovvenzione Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid e UAM).

Tutte le procedure di allevamento e sperimentazione dei topi devono essere condotte in conformità con la legislazione locale, nazionale, internazionale e le linee guida sulla sperimentazione animale.
1. Induzione della crescita dei peli, induzione delle ustioni e identificazione di LRC BrdU a lungo termine nell'epitelio della pelle della coda wholemounts
NOTA: Utilizzare topi C57BL/6 di 10 giorni o 7 settimane, preferibilmente cucciolate, per i disegni sperimentali descritti di seguito. In tutte le procedure sperimentali, gli animali saranno anestetizzati mediante inalazione di isoflurano al 3% o eutanasia mediante dislocazione cervicale come indicato.
<ol><li>Induzione della crescita dei peli nella pelle posteriore dei topi nella seconda fase telogen (a riposo) (circa giorno 50 post-natale)<ol><li>Anestetizzare i topi con inalazione di isoflurano al 3%. Confermare l'anestesia profonda completa per mancanza di un riflesso del pedale (pizzico fermo della punta). Rasare due regioni indipendenti affiancate della pelle posteriore in ogni singolo topo usando tagliacapelli e crema depilatoria (Table of Materials). Utilizzare il lato sinistro per il controllo e il lato destro per il trattamento. NOTA: Controllare che, dopo la rasatura, la pelle posteriore sottostante sia rosata e non grigia/nera, indicatore di melanogenesi e ingresso nella fase anagen (crescita) in questo ceppo murino.</li>
		<li>Lavare accuratamente con PBS per rimuovere tutti i residui di crema e procedere all'induzione della produzione transitoria in situ di livelli di ROS non letali come descritto nel paragrafo 2.1.</li>
		<li>Registra la crescita del follicolo pilifero attraverso l'acquisizione giornaliera di immagini ad alta risoluzione delle aree della pelle posteriore di controllo e trattate in ciascun animale (ad esempio, utilizzando una videocamera HD accoppiata a un obiettivo binoculare 5-20x).</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione di lesioni da ustione di 2° grado nella pelle posteriore dei topi nella seconda fase telogen (a riposo) (circa giorno 50 post-natale)<ol><li>Anestetizzare i topi. Rasare l'intera regione della pelle posteriore in ogni singolo topo usando tagliacapelli e crema depilatoria e lavare accuratamente con PBS per rimuovere tutti i resti di crema. NOTA: Somministrare in situ iniezioni sottocutanee di lidocaina allo 0,5% (2 mg/ml) in soluzione salina sterile, non superiore a 7 mg/ml, poco prima della procedura di combustione.</li>
		<li>Preriscaldare una barra di ottone (1 cm di sezione trasversale) a 95 °C immergendola in acqua bollente e quindi applicare sulla regione centrale della superficie dorsale della pelle dorsale di ciascun topo per 5 s.</li>
		<li>Subito dopo la generazione di ustioni, iniettare per via intraperitoneale gli animali con 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) su una coperta elettrica per prevenire la disidratazione. Lasciare che gli animali si riprendano per 24 ore e procedere all'induzione della produzione transitoria in situ di livelli di ROS non letali, come descritto nel paragrafo 2.3.</li>
		<li>Registrare la progressione della ferita da ustione attraverso l'acquisizione giornaliera di immagini ad alta risoluzione delle aree della pelle posteriore di controllo e trattate in ciascun animale (ad esempio, utilizzando una telecamera HD accoppiata a un obiettivo binoculare 5-20x).</li>
	</ol></li>
	<li>Generazione e identificazione di LRC BrdU a lungo termine nell'epitelio della pelle della coda<ol><li>Iniettare compagni di cucciolata di 10/14 giorni per via intraperitoneale (senza anestesia) una volta al giorno per 4 giorni consecutivi con 50 mg/kg di peso corporeo di BrdU sciolto in PBS. Dopo la fase di etichettatura, lasciare crescere i topi per 50-60 giorni prima di qualsiasi trattamento. NOTA: Usi un ago nuovo per ogni iniezione.</li>
		<li>Procedere come descritto nel paragrafo 2.3 per l'induzione della produzione transitoria di ROS non letale in situ nella pelle della coda in momenti diversi prima della preparazione del tessuto intero.</li>
		<li>Per preparare interi monti di epidermide della coda, eutanasia topi per lussazione cervicale e tagliare le code con forbici chirurgiche.<ol><li>Usa un bisturi per fare un'incisione longitudinale dritta lungo tutta la coda e sbuccia l'intera pelle come un unico pezzo dalla spina dorsale. Incubare la pelle pelata in 5 mM EDTA in PBS in tubi da 5 mL per 4 ore a 37 °C e separare accuratamente i fogli intatti di epidermide dal derma usando una pinza.</li>
			<li>Fissare il tessuto in formaldeide al 4% in PBS per almeno 72 ore a temperatura ambiente (RT) e procedere per il rilevamento di BrdU utilizzando anticorpi appropriati.</li>
			<li>Utilizzare la microscopia a fluorescenza/confocale per identificare e quantificare le LRC in ogni condizione sperimentale, compresi i controlli della luce e i trattamenti fotodinamici in momenti diversi prima della preparazione del tessuto intero, come precedentemente descritto in dettaglio19,20. NOTA: I fogli epidermici fissi possono essere conservati in PBS contenenti azoturo di sodio allo 0,02% a 4 °C per un massimo di tre mesi. I fogli epidermici fissi possono essere utilizzati per l'immunolocalizzazione delle proteine richieste seguendo le procedure standard delle sezioni istologiche.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Induzione della produzione transitoria di livelli di ROS non letali nella pelle del topo
NOTA: Per indurre la produzione transitoria di livelli di ROS non letali nella pelle del topo, verrà utilizzato un trattamento fotodinamico utilizzando un precursore del fotosensibilizzatore endogeno PpIX, in questo caso, metil-amminolevulinato (mALA) e luce rossa.
<ol><li>Per attivare la produzione transitoria di ROS per l'induzione della crescita dei peli nella pelle posteriore, preparare gli animali come indicato nel paragrafo 1.1.<ol><li>Applicare ~ 25 mg di mALA sotto forma di crema topica (Table of Materials) sulla regione destra, mantenendo il lato sinistro come controllo interno evitando differenze interindividuali. Incubare per 2,5 ore al buio, lavare accuratamente la crema in eccesso con PBS. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero. NOTA: La produzione di PpIX nella pelle posteriore deve essere testata in situ mediante la sua fluorescenza rossa sotto eccitazione di luce blu (407 nm).</li>
		<li>Anestetizzare gli animali.</li>
		<li>Irradiare tutta la pelle della schiena con un'adeguata fonte di luce rossa (Table of Materials) per una dose totale di 2,5−4 J/cm2. Tenere i topi su una coperta elettrica fino al loro completo recupero e procedere come descritto al punto 1.1.3. NOTA: L'irraggiamento deve essere regolato manipolando la distanza tra la sorgente luminosa e il tessuto e misurato utilizzando un misuratore di energia (Tabella dei materiali). L'esperimento è considerato finito quando si osserva una crescita completa dei peli in una qualsiasi delle regioni rasate indipendenti di ciascun animale. L'intera procedura prevede un solo trattamento fotografico.</li>
	</ol></li>
	<li>Per attivare la produzione transitoria di ROS per il miglioramento della guarigione delle lesioni da ustione di 2° grado, preparare gli animali come indicato nella sezione 1.2.<ol><li>Applicare ~ 25 mg di mALA sotto forma di crema topica lungo tutta la superficie bruciata, comprendendo circa 4 mm di tessuto adiacente. Incubare per 2,5 ore al buio, lavare accuratamente la crema in eccesso con PBS. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero.</li>
		<li>Anestetizzare gli animali.</li>
		<li>Irradiare l'intera pelle della schiena con un'adeguata fonte di luce rossa per una dose totale di 2,5−4 J/cm2. Tenere i topi su una coperta elettrica fino al loro completo recupero e procedere come descritto al punto 1.2.4. NOTA: La procedura sperimentale per ciascun animale è considerata conclusa quando si osserva la completa guarigione delle ustioni. L'intera procedura prevede un solo trattamento fotografico.</li>
	</ol></li>
	<li>Per attivare la produzione transitoria di ROS nella pelle della coda, preparare i topi come indicato nel paragrafo 1.3, applicare ~25 mg di mALA sotto forma di crema topica lungo tutta l'area del tessuto dorsale e procedere come descritto nel paragrafo 2.1 per la pelle della schiena. Eseguire trattamenti fotografici e corrispondenti controlli della luce 24 ore, 48 ore o 72 ore prima dell'eutanasia animale e dell'ulteriore estrazione della pelle della coda intere montature. NOTA: In tutti i progetti sperimentali, analizzare la ROS-dipendenza del processo utilizzando scavenger antiossidanti ROS (ad esempio, inoculazione giornaliera di 100 mg/kg di peso corporeo N-acetil-cisteina mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione da 20 mg/ml in PBS, pH 7,2, iniziando 5 giorni prima dei trattamenti con mALA o, in alternativa, due dosi di 100 mg/ml di acido ascorbico in etanolo al 50%, distanziato di 30 minuti, applicato localmente sulla pelle nell'intervallo di tempo tra i trattamenti mALA e l'irradiazione a luce rossa).</li>
</ol>3. Rilevamento ROS nella pelle
<ol><li>Valutazione ex vivo della produzione di ROS nella pelle della coda dopo trattamento fotodinamico con idroetidina NOTA: L'idroetidina è una molecola non fluorescente che reagisce specificamente con i ROS per produrre colorante fluorescente 2-idrossietidio (hET).<ol><li>Incubare pelli intere della coda, ottenute come descritto al punto 1.3.3, per 3 ore a 37 °C in 5 mM di EDTA in soluzione PBS (campioni di controllo) o contenenti inoltre 2 mM di mALA (campioni di trattamento fotodinamico).</li>
		<li>In tutti i casi, aggiungere idroetidina a una concentrazione finale di 3,2 μM da uno stock di 25 mg/ml in dimetilsolfossido (DMSO) e incubare per 1 ora al buio a RT.</li>
		<li>Allungare i campioni di pelle della coda su una superficie di vetro usando la punta delle dita e irradiare con luce rossa a 636 nm con una fluenza di 10 J/cm2 .</li>
		<li>Procedere immediatamente a separare l'epidermide dal derma e a fissare i fogli epidermici come descritto al paragrafo 1.3.3.</li>
		<li>Valutare l'emissione rossa hET al microscopio a fluorescenza/confocale utilizzando la luce verde eccitante, acquisire immagini di alta qualità e procedere con ulteriori analisi. NOTA: Utilizzare la colorazione hET dei campioni di tessuto in assenza di trattamento fotodinamico come controllo negativo per l'autossidazione hET.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento in vivo della produzione di ROS nella pelle posteriore dopo induzione della crescita dei peli e guarigione delle ustioni seguita da trattamento fotodinamico NOTA: Questo passaggio viene eseguito utilizzando 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DHF-DA), un composto non fluorescente permeato da cellule che, dopo la scissione da parte degli enzimi esterasi intracellulari, reagisce specificamente con i ROS dando il colorante fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceina (DCF).<ol><li>Utilizzare animali preparati per l'induzione della crescita dei peli (paragrafo 1.1) o la guarigione delle ustioni (paragrafo 1.2). Appena prima dei trattamenti topici con mALA crema (vedere paragrafi 2.1 e 2.2), erogare localmente 100 μL di 1 mg/ml in etanolo al 50% di DHF-DA su tutte le aree cutanee di controllo target/trattate, lasciare che la pelle assorba completamente il materiale e procedere con l'applicazione topica della crema mALA.</li>
		<li>Incubare gli animali trattati per 4 ore al buio, lavare accuratamente la crema topica mALA dalla pelle con PBS e dispensare una seconda dose di 100 μL di soluzione di DHF-DA sulla pelle. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero.</li>
		<li>Incubare gli animali trattati per 50 minuti al buio, anestetizzare e irradiare tutta la pelle della schiena con una fluenza che va da 2,5 a 4 J/cm2 di luce rossa a 636 nm utilizzando una lampada a LED.</li>
		<li>Immediatamente dopo l'irradiazione, valutare i livelli di ROS generati nella pelle utilizzando un sistema di imaging in vivo (Table of Materials). Impostare la scatola del filtro per l'eccitazione a 445-490 nm e l'emissione di 515-575 nm, acquisire immagini di alta qualità e procedere con ulteriori analisi. NOTA: Utilizzare la colorazione DHF-DA dei campioni di tessuto in assenza di trattamento fotodinamico come controllo negativo per l'autossidazione DHF-DA.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Bl&#225;zquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+1O2+optical+excitation:+A+tool+for+redox+biology.">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li><li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease.">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li><li>Sena, L. A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Roles+of+Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species.">Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species.</a> Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).</li><li>Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+Destroyers+or+messengers.">Reactive oxygen species: Destroyers or messengers.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).</li><li>Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+from+health+to+disease.">Reactive oxygen species: from health to disease.</a> Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).</li><li>Speakman, J. R., Selman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+free-radical+damage+theory:+Accumulating+evidence+against+a+simple+link+of+oxidative+stress+to+ageing+and+lifespan.">The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan.</a> BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).</li><li>Fernandez, V., Videla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+aspects+of+cellular+antioxidant+systems.">Biochemical aspects of cellular antioxidant systems.</a> Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).</li><li>Mat&#233;s, J. M., S&#225;nchez-Jim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+enzymes+and+their+implications+in+pathophysiologic+processes.">Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes.</a> Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+Family+of+ROS-Generating+NADPH+Oxidases:+Physiology+and+Pathophysiology.">The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases.">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez-Garc&#237;a, D., Wood, C. D., Castro-Obreg&#243;n, S., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+A+radical+role+in+development.">Reactive oxygen species: A radical role in development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).</li><li>Covarrubias, L., Hern&#225;ndez-Garc&#237;a, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obreg&#243;n, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+Passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development:+Regulation+and+responses.">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li><li>Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+prime+Drosophila+haematopoietic+progenitors+for+differentiation.">Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation.</a> Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-Dependant+Manner.">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Hamanaka, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species+Promote+Epidermal+Differentiation+and+Hair+Follicle+Development.">Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development.</a> Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).</li><li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing.">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li><li>Carrasco, E., Bl&#225;zquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, &. #. 1. 9. 3. ;., Espada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+on+a+transient+endogenous+ROS+production+in+mammalian+cells+and+tissues.">Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues.</a> Methods. , 109 (2016).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Hsu, Y. -. C., Li, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+interactions+between+skin+stem+cells+and+their+niches.">Emerging interactions between skin stem cells and their niches.</a> Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).</li><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells+and+implications+for+wound+repair.">Epithelial stem cells and implications for wound repair.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).</li></ol>

Tutte le applicazioni commerciali delle procedure descritte in questo lavoro sono protette da un brevetto CSIC-UAM (EP2932967A1) redatto da EC, MIC e JE e concesso in licenza a Derma Innovate SL per lo sfruttamento commerciale. JE e JJM hanno una posizione di consulenza in Derma Innovate SL.

Qui presentiamo una metodologia che consente un'attivazione transitoria della produzione endogena di ROS in vivo nella pelle di topo con effetti fisiologici. La metodologia si basa su una procedura fotodinamica per indurre una stimolazione controllata e locale del fotosensibilizzatore endogeno PpIX (Figura 1B). Questo approccio sperimentale è uno strumento interessante per studiare la biologia dei ROS in sistemi sperimentali in vivo che costituiscono un progresso significativo rispetto alle...

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono il risultato della riduzione chimica dell'ossigeno molecolare per formare acqua e includono ossigeno singoletto, anione superossido, perossido di idrogeno e il radicale ossidrile 1,2,3. I ROS hanno una durata molto breve a causa della loro natura estremamente reattiva chimica. Negli organismi aerobici, i ROS si formano incidentalmente all'interno delle cellule come un importante sottoprodotto della respirazione aerobica (catena di trasporto degli elettroni) nei mitocondri. L'accumulo transitorio di alti livelli di ROS nella cellula provoca una condizione di stress ossidativo che può provocare l'inattivazione irreversibile di proteine, lipidi e zuccheri e l'introduzione di mutazioni nella molecola di DNA 2,3,4,5. Il graduale accumulo di danno ossidativo nelle cellule, nei tessuti e negli organismi interi aumenta costantemente con il tempo ed è stato associato all'induzione di programmi di morte cellulare, diverse patologie e il processo di invecchiamento 2,3,4,6.
Gli organismi aerobici hanno costantemente sviluppato meccanismi molecolari efficienti per affrontare l'accumulo di ROS in eccesso nelle cellule e nei tessuti. Questi meccanismi includono membri della famiglia delle proteine superossido dismutasi (SOD), che catalizzano la dismutazione radicalica del superossido in ossigeno molecolare e perossido di idrogeno, nonché diverse catalasi e perossidasi che utilizzano il pool antiossidante (glutatione, NADPH, perossiredossina, tioredossina 7,8) per catalizzare la successiva conversione del perossido di idrogeno in acqua e ossigeno molecolare.
Tuttavia, diversi rapporti supportano il ruolo dei ROS come componenti chiave dei circuiti molecolari che regolano le funzioni cellulari critiche, tra cui proliferazione, differenziazione e mobilità 2,3,4. Questo concetto è ulteriormente supportato dall'identificazione iniziale e dalla caratterizzazione di meccanismi dedicati che producono ROS in organismi aerobici, tra cui le lipossigenasi cicloossigenasi e le NADPH ossidasi 9,10. In questo senso, i ROS mostrano un ruolo attivo durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati 11,12,13 e ruoli chiave per queste molecole nella regolazione di specifiche funzioni fisiologiche in vivo sono stati riportati in diversi sistemi sperimentali, tra cui il programma di differenziazione dei progenitori ematopoietici in Drosophila14, l'induzione di guarigione nel pesce zebra o la rigenerazione della coda nei girini di Xenopus 15. Nei mammiferi, i ROS sono stati coinvolti nel potenziale di auto-rinnovamento/differenziazione delle cellule staminali neurali in un modello di neurosfera16 e nella deregolazione della funzione delle cellule staminali intestinali durante l'inizio del cancro del colon-retto17. Nella pelle, la segnalazione dei ROS è stata associata alla differenziazione epidermica e alla regolazione della nicchia delle cellule staminali cutanee e del ciclo di crescita del follicolo pilifero18,19.
In questa prospettiva, una delle principali limitazioni sperimentali per determinare i ruoli fisiologici dei ROS nei sistemi biologici, sia in condizioni normali che patologiche, è la mancanza di adeguati strumenti sperimentali per indurre una produzione controllata di queste molecole in cellule e tessuti, assomigliando accuratamente alla loro produzione fisiologica come messaggeri di seconda segnalazione. Allo stato attuale, la maggior parte degli approcci sperimentali prevede la somministrazione di ROS esogeni, principalmente sotto forma di perossido di idrogeno. Abbiamo recentemente implementato un approccio sperimentale per attivare una produzione transitoria e non letale in vivo di ROS endogeni nella pelle del topo, basato sulla somministrazione di precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX (PpIX; ad esempio, acido aminolaevulinico o il suo derivato metilamminolevulinato) e ulteriore irradiazione del campione con luce rossa per indurre la formazione in situ di ROS dall'ossigeno molecolare intracellulare (Figura 1). Questa procedura fotodinamica può essere efficacemente utilizzata per stimolare nicchie di cellule staminali residenti, attivando così i programmi rigenerativi del tessuto19,20 e aprendo la strada a nuove modalità terapeutiche nella medicina rigenerativa cutanea. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del protocollo, mostrando esempi rappresentativi di stimolazione di nicchie di cellule staminali, misurata come un aumento del numero di cellule di mantenimento dell'etichetta (LRC) a lungo termine di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) nella regione del rigonfiamento del follicolo pilifero19,21 e successiva attivazione di programmi di rigenerazione (accelerazione della crescita dei capelli e processi di guarigione delle ustioni) indotti da transitori, produzione non letale di ROS nella cute del ceppo di topo C57Bl6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="811">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescin diacetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">D6883-50MG</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5&#39;-bromo-2&#39;-deoxiuridine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein</td>
			<td style="width:104px;">Roche</td>
			<td>11202693001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depilatory cream (e.g., Veet)</td>
			<td style="width:104px;">Veet</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Dihydroethidium</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2</td>
			<td style="width:104px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g</td>
			<td style="width:104px;">Galderma</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)</td>
			<td style="width:104px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp</td>
			<td style="width:104px;">Photocure ASA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stimulation of stem cell niches and tissue regeneration in mouse skin by switchable protoporphyrin ix-dependent photogeneration of reactive oxygen species in situ

Qui, descriviamo un protocollo per indurre la fotogenerazione commutabile in vivo di specie reattive dell'ossigeno endogene (ROS) nella pelle del topo. Questa produzione transitoria di ROS in situ attiva in modo efficiente la proliferazione cellulare nelle nicchie delle cellule staminali e stimola la rigenerazione dei tessuti come fortemente manifestato attraverso l'accelerazione della guarigione delle ustioni e dei processi di crescita del follicolo pilifero. Il protocollo si basa su un trattamento fotodinamico regolabile che tratta il tessuto con precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX e irradia ulteriormente il tessuto con luce rossa sotto parametri fisico-chimici strettamente controllati. Nel complesso, questo protocollo costituisce un interessante strumento sperimentale per analizzare la biologia dei ROS.

La somministrazione topica del precursore mALA nella pelle della schiena e della coda del topo provoca un accumulo significativo di PpIX nell'intero tessuto e, notevolmente, nel follicolo pilifero, come dimostrato dalla fluorescenza rosa-rossastra di questo composto sotto eccitazione di luce blu (407 nm) (Figura 2A,C). La successiva irradiazione del tessuto trattato con luce rossa (636 nm) ad una fluenza di 2,5−4 J/cm 2 promuove la produzione transitoria di ROS ...

Watch this Scientific Journal Video about Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In 

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Lo scopo di questo protocollo è quello di indurre la produzione transitoria in vivo di livelli non letali di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella pelle del topo, promuovendo ulteriormente le risposte fisiologiche nel tessuto.

Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

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Research

JoVE Journal

Biology

1.9K Views.  Ramón y Cajal University Hospital. Lo scopo di questo protocollo è quello di indurre la produzione transitoria in vivo di livelli non letali di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella pelle del topo, promuovendo ulteriormente le risposte fisiologiche nel tessuto.

Video: Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling structure that forms rapidly post-amputation and is required for limb regeneration. However, methods to study its precise function at the molecular level over the last decades have been limited due to a paucity of precise functional techniques and genomic information available in salamander model systems. Excitingly, the recent plethora of sequencing technologies coupled with the release of various salamander genomes and the advent of functional genetic testing methods, including CRISPR, makes it possible to re-visit these foundational experiments at unprecedented molecular resolution. Here, I describe how to perform the classically developed full skin flap (FSF) surgery in adult axolotls in order to inhibit wound epidermis formation immediately following amputation. The wound epidermis normally forms via distal migration of epithelial cells in the skin proximal to the amputation plane to seal off the wound from the outside environment. The surgery entails immediately suturing full thickness skin (which includes both epidermal and dermal layers) over the amputation plane to hinder epithelial cell migration and contact with the underlying damaged mesenchymal tissues. Successful surgeries result in the inhibition of blastema formation and limb regeneration. By combining this surgery method with contemporary downstream molecular and functional analyses, researchers can begin to uncover the molecular underpinnings of wound epidermis function and biology during limb regeneration.

This article describes how to perform a surgical method to inhibit wound epidermis formation during axolotl limb regeneration by immediately suturing full thickness skin over the amputation plane. This method allows researchers to investigate the functional roles of the wound epidermis during the early stages of limb regeneration.

Inibizione della formazione dell'epidermide della ferita tramite chirurgia del lembo della pelle completa durante la rigenerazione degli arti Axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.