Name: echocardiographic and histological examination of cardiac morphology in the mouse
Uploaded: 2017-10-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse at JoVE.com

O trabalho foi financiado pelo governo francês (Agência Nacional de pesquisa, ANR) através do programa "Os investimentos para o futuro" LABEX SIGNALIFE (referência ANR-11-LABX-0028-01) e por subsídios para K. d. W. da Associação pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France e planejar Inserm de câncer. D. B. e V. a. receberam bolsas do Fondation pour la Recherche Médicale e partir da cidade de Nice, respectivamente. O ecocardiográficos e o transdutor foram gentilmente fornecidos pela Philips. Agradecemos Borderie r., S. Destree, M. Cutajar-Bossert, r. Landouar, r. Martres, r. Biancardini e S. M. Wagner por sua assistência técnica qualificada.

os experimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as leis de bem-estar animal francês e institucionais relevantes, diretrizes e políticas. Foram aprovados pelo Comitê de ética francês (Comité Institutionnel d &#39; Ethique Pour L' &#39; Animal de Laboratoire; número NCE/2012-106).
 1. ecocardiografia <ol><li>determinar o peso do corpo do mouse utilizando uma balança de laboratório padrão, mantendo-a levemente pela cauda para garantir o posicionamento adequado.</li>
	<li>Anestesiar o animal pela injeção intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26. 
	Nota: Qualquer outro tipo de anestesia pode ser usado se o mesmo protocolo que é usado ao longo do estudo. Vantagens e desvantagens serão discutidas abaixo.</li>
	<li>o mouse de volta em sua própria gaiola e espere até que ele não está respondendo, ele mostra a respiração firme, e pé traseiro reflexos estão ausentes. Para testar isso, esprema um pé ligeiramente e observar se a perna ainda retrai.</li>
	<li>Raspar o lado esquerdo do tórax e a axila esquerda, usando uma máquina de barbear roedor comercial. 
	Nota: O uso de uma máquina de barbear roedor dedicado permite a remoção completa dos pelos de rato bem para evitar a interferência na medição ecocardiográfica. Comercial de cabelo remoção cremes ou soluções devem ser evitadas, como eles geralmente são perfumados, que irá perturbar o animal depois que ela desperta. Evite barbear excessiva, pois aumenta a perda de calor.</li>
	<li>Colocar o animal dormindo sobre uma almofada quente consta para 40-42 ° C em uma posição superficial lado esquerdo, com a cabeça em 12 o &#39; relógio e a cauda em 6 o &#39; relógio. Fixar o braço esquerdo, perna esquerda e cauda com fita.</li>
	<li>Aplicar pré aquecido ecocardiografia gel para o peito depilado e a cabeça do transdutor.</li>
	<li>Coloca o transdutor paraesternal esquerdo, dirigindo-a para o lado direito do pescoço para obter um bidimensional (2D) longo-eixo esternal no nível do músculo papilar. O transdutor 90° gire no sentido horário para obter uma visão do eixo curto a nível do músculo papilary. Use uma configuração de profundidade mínima e um zoom para maximizar a imagem qualidade e taxa de quadros. Definir a velocidade de varredura para o máximo.
	<ol><li>Para obter essas configurações, definindo opções de profundidade e zoom diferente pode ser usado, dependendo da máquina e software. Gravar imagens de M-modo 2D-interativa no eixo curto ver 27. Consulte a figura 1A e B 27. 
		Nota: tenha cuidado para evitar aplicar pressão excessiva no peito, pois isso pode causar bradicardia.</li>
	</ol></li> <li>Série de registro pelo menos 3 de 3 loops de cine batida de coração por cada animal. 
	Nota: Para o software ecocardiográficos utilizado neste estudo, pressione o &#34; adquirir/Save &#34; o botão apenas uma vez. Esta metodologia é específica para o ecocardiográficos com este software específico. Outros pacotes de software podem ser usados com diferentes máquinas.</li>
	<li>Depois de gravações bem sucedidas, limpe a Ecocardiografia do gel do tórax de rato, almofada de aquecimento e transdutor. Remova a fita de membros e cauda.</li>
	<li>Deixar o mouse sob observação na rampa de aquecimento, coberta com tecido para evitar desnecessária exposição e calor perda de luz, até que ele acorda de cima</li>
	<li>Coloque o animal de volta em sua jaula.</li>
	<li>Analyze gravou imagens da M-modalidade de esternal eixo curto para determinar a função e ventricular esquerdo (LV) dimensões. Medir a espessura de parede anterior LV na sístole e diástole (LVAWs e LVAWd), os LV final-sistólica e diastólica final diâmetros internos (LVIDs e LVIDd) e a espessura de parede posterior de LV (LVPW) em sístole e a diástole (LVPWs e LVPWd) usando o identificação da interface tecido-sangue sobre as imagens armazenadas.</li>
	<li>Medir as dimensões diastólica aquando da aparente máxima LV diastólica dimensões e LV dimensões sistólica-final no momento da excursão sistólica mais anterior da parede posterior da LV. Toque de tela sensível ao toque no &#34; Analyze &#34; ícone e, em seguida, sobre o &#34; LVAWd &#34; ícone. Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior LV em diástole.</li>
	<li>Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do LV e cavidade para obter a espessura de parede anterior diastólica LV LV; o software vai mudar diretamente para a medição final-diastólica interna de LV.</li>
	<li>Posicionar o paquímetro na interface entre a cavidade de LV e a parede posterior de LV para obter o diâmetro diastólico final interno LV; o software vai mudar para a medição de espessura de parede posterior de LV.</li>
	<li>Posicionar o paquímetro na interface entre a parede posterior do LV e o pericárdio para obter a espessura de parede posterior diastólica LV. Para dimensões sistólica LV, toque a tela de toque sobre o &#34; LVAWs &#34; ícone e posição o compasso de calibre eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior do LV no systole.</li>
	<li>Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do LV e cavidade para obter a espessura de parede anterior sistólica LV LV. Repita o processo conforme descrito acima para o diâmetro final-sistólica interno de LV e a espessura da parede posterior sistólica LV. Use a Convenção de ponta adotada pela sociedade americana de ecocardiografia para rastrear as fronteiras endocárdico e epicárdico 13 , 27. 
	Nota: Parâmetros da função contrátil LV serão automaticamente calculados usando as medidas anteriores. O LV fracionária de encurtamento (FS) é definido como FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. A fração de ejeção de LV (EF) é calculada com a fórmula modificada de Teicholz, onde EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Consulte a figura 1A e B.</li>
	<li>Armazenar os dados em CDs ou cartões de memória USB e faça cópias de backup.</li>
	<li>Importação, analisar e exportar os dados usando o software apropriado. 
	Nota: Após as medições de linha de base, o experimento pode ser pausado. Se realizar uma comparação direta entre animais nocaute e selvagem-tipo littermates, prosseguir com a análise histológica 6. Para Cre-ERT2; linhas de rato de salmão/salmão fumado, continuar no dia seguinte com tamoxifeno indução por injeção i.p., como descrito na 5 , 24. Se induzir miocárdio experimental pela ligadura da artéria coronária esquerda 5 , 28, a cirurgia poderia ser realizada diretamente após as medidas ecocardiográficas, quando os ratos estão sob anestesia. Caso contrário, um prazo mínimo de uma semana entre as duas rodadas da anestesia deve ser mantido para limitar a taxa de letalidade pós-operatória.</li>
</ol> 2. Preparação de amostras de coração para avaliação histológica <ol><li>sacrificar os animais por deslocamento cervical. Meça seu peso corporal. Desinfectar o peito e abdômen, usando um algodão embebido em álcool 70%.</li>
	<li>Fazer uma incisão transversa na pele 1cm distal ao esterno. Usando pinças sem corte, retire a pele do tórax, indo na direção da cabeça. Segure o esterno levemente com a pinça fina e abrir o diafragma, inserindo o fim brusco da tesoura bem.</li>
	<li>Cortar a caixa torácica em ambos os lados paralelos ao esterno. Mova o esterno na direção da cabeça. Localize o coração no tórax. Mantenha o tronco vascular do coração com a pinça fina e corte abaixo usando a tesoura bem.</li>
	<li>Abra o baú e retirar todo o coração fora do tórax, medir o peso de coração e estabelecer um peso do coração-a-corpo relação 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 .</li>
	<li>Fix o coração em 2 mL de solução de formol tamponado a 10% neutro em tubos de 15 mL a noite no 4 ° C. 
	Cuidado: perigo! Trabalho com soluções de formalina deve ser feito em uma coifa de química; usar luvas e óculos de segurança. 
	Nota: Como a composição do tampão de soluções de formol varia com diferentes fornecedores, utilize o mesmo fornecedor ao longo do estudo.</li>
	<li>No dia seguinte, cortar os corações no plano transversal, no meio e transferi-los para fitas para a incorporação de parafina, que é realizada no laboratório de patologia, usando um aparelho automatizado de encastre.</li>
	<li>Executar seccionamento.
	<ol><li>Blocos de parafina de seção em uma espessura de 3 µm usando um micrótomo e boia-los em uma água de 40 ° C do banho com água destilada.</li>
		As seções sobre guias de transferência de <li>. Permitir que os slides para secar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C e armazená-los em 4 ° C até que esteja pronto para uso. 
		Nota: O protocolo pode ser pausado aqui até que o usuário está pronto para a coloração (etapa 3).</li>
	</ol></li> <li>Deparaffinize e hidratar o tecido desliza.
	<ol><li>Coloque os slides na coloração de frascos com pastilhas de vidro em um forno de 55 ° C por 10 min derreter a parafina.</li>
		<li>Deparaffinize os slides em duas mudanças de 200ml de xilol ou xileno substituto por 5 min cada. 
		Atenção: Altamente inflamável e tóxico! Trabalho em uma coifa de química; usar luvas e óculos de segurança.</li>
		<li>Transferir os slides para 200 mL de álcool a 100%. Fazer duas alterações por 3 min cada e transferir uma vez através de 200 mL de álcool 95% por 3 min. 
		Cuidado: Inflamável! Mantenha longe de fontes de ignição; Não se pode fumar.</li>
		<li>Lavar duas vezes em 200 mL de tampão fosfato solução salina (PBS) por 5 min cada e continue com o passo 3, 4 ou 5.</li>
	</ol></li></ol> 3. Hematoxilina e eosina coloração <ol><li>enxaguar os slides com suas seções em água destilada.</li>
	<li>Mancha os núcleos com solução de hematoxilina de 8 min.</li>
	<li>Enxaguar em água corrente durante 10 min.</li>
	<li>Mancha com solução de eosina por 2 min.</li>
	<li>Desidratando três vezes por 2 min em 100% de etanol (EtOH). Limpe 3 vezes por 2 min em xilol ou xileno substituto. Monte em um meio de montagem baseada em xileno.</li>
	<li>Fotografar os slides e medir o diâmetro de casos a nível do núcleo em secções longitudinais do septo interventricular. Medir a pelo menos 100 células por seção e três seções por coração.</li>
</ol> 4. Coloração de WGA <ol><li>a incubar obtidos de passo 2.7 com diversos (ou outros corantes fluorescentes)-conjugados WGA (1: 100 em PBS) para 60 min à temperatura ambiente em uma câmara húmida.</li>
	<li>Lave tres vezes com PBS por 5 min cada.</li>
	<li>Montagem com fluorescência montagem mídia contendo DAPI. Loja a 4 ° C, no escuro antes da análise. 
	Cuidado: Use proteção para os olhos e luvas resistentes a produtos químicos compatíveis.</li>
	<li>Fotografar os slides.
	<ol><li>Uso um microscópio equipado com epi-iluminação de fluorescência e filtro define para DAPI e diversos (consulte a Tabela de materiais). Definir a abertura para o máximo e o brilho para auto-exposição.</li>
		<li>Adquirir separa imagens na ampliação de x 400 para o azul e os vermelhos canais. Abra as imagens no ImageJ. Ajustar o brilho e o contraste se necessário (imagem &#62; ajuste &#62; brilho/contraste).</li>
		<li>Definir cada imagem de 8 bits (imagem &#62; tipo &#62; 8-bit). Sobrepor as imagens DAPI e WGA. Use o canal azul para DAPI e o canal vermelho para WGA; definir os canais verdes e cinzento para none (imagem &#62; cor &#62; mesclar canais) 31.</li>
	</ol></li> <li>Determinar os diâmetros de casos a nível do núcleo em secções transversais do septo interventricular.
	<ol><li>Define a escala das imagens no ImageJ. Para este efeito, fotografar um objeto de tamanho conhecido (por exemplo, uma câmara de hemocytometer a mesma ampliação como as seções de coração; passo 4.4).</li>
		<li>Usar a ferramenta em linha reta para desenhar uma linha do começo ao fim da estrutura conhecida (Analyze &#62; definir escala). 
		Nota: A distância em pixels será exibida automaticamente; a unidade de comprimento e distância conhecida terá que ser inserido. Prosseguir com as medições de casos a nível do núcleo.</li>
		<li>Desenhar uma linha reta da membrana WGA-positivo através do núcleo de DAPI-positivo para o site oposto da membrana celular WGA-positivo (Analyze &#62; medida). Na janela de resultados, verifique se os valores de comprimento tem um significativo número de casas decimais (Analyze &#62; definir medidas &#62; casas decimais).</li>
		<li>Medida pelo menos 100 células por seção e três seções pelo coração. Exportar os resultados para Excel (clique em resultados &#62; arquivo &#62; salve como &#62;. csv) 6 , 31.</li>
	</ol></li></ol> 5. Immunostaining pecam-1 <ol><li>executar o antígeno desmascaramento.
	Buffer <ol><li>Adicionar 1.600 mL de citrato de sódio (citrato de sódio de 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6.0) para uma panela de pressão. Coloque a panela sobre a chapa e transformá-lo em força total. Não prenda a tampa da panela de pressão neste ponto; simplesmente coloque-o no topo. 
		Cuidado: Quente!</li>
		<li>, Uma vez que o tampão de citrato de sódio está fervendo, transferir os slides da etapa 2.5 para a panela de pressão. Fixe a tampa da panela de pressão. Assim que a panela atingir pressão completa, espere por 7 min. Quando transcorridos 7 min, desligue a chapa e coloque a panela de pressão em um coletor de vazio. Ativar a válvula de alívio de pressão e correr água fria sobre o fogão. Uma vez que ele tem de pressurizado, abra a tampa e correr água fria na panela de 5 min. do lugar os slides em 200 mL de PBS. 
		Nota: Como alternativa, desmascaramento de antígeno de microondas poderia ser utilizado, embora o risco de superaquecimento é aumentado.</li>
	</ol></li> <li>Uso 0,3% de peróxido de hidrogênio em metanol para atividade de peroxidase endógena bloco 5 min. enxágue os slides para três vezes por 2 min cada em 200 mL de PBS. 
	Cuidado: Inflamável e tóxico!</li>
	<li>a incubar por 15 min em diluídos bloqueio soro normal (5% de soro de cabra normal em PBS) que também contém um bloco de avidina (4 gotas em 1 mL).</li>
	<li>Com cuidado toque o líquido das seções e incube-os com Pecam-1 anticorpos de coelho, diluída 01:50 em PBS contendo 2,5% de soro de cabra normal e 4 gotas de bloco de biotina por mL. Incubar os slides durante a noite em uma câmara húmida a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS. Incube as secções com biotinilado cabra anti-coelho IgG anticorpo diluído 1: 200 em PBS contendo 2,5% de soro de cabra normal por 1h à temperatura ambiente. Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS.</li>
	<li>Incubar tseções do com um sistema baseado em avidina/biotina peroxidase por 20 min (Reagente A e Reagente B precisa ser combinados 30 minutos antes de usar). Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS.</li>
	<li>Dissolver 1 3,3 &#39;-diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio 1 ureia comprimido em 5 mL de água bidestilada. Incube as secções com DAB solução por aproximadamente 3 min, monitorando cuidadosamente desenvolvimento de cor. Parar a reação de cor lavando suavemente os slides em 200 mL de PBS. 
	Cuidado: Cancerígenos; usar luvas resistentes a produtos químicos!</li>
	<li>Counterstain os núcleos para 6 min com hematoxilina. Enxaguar em água corrente por 2 min. desidratando por 2 min cada por três vezes em 200 mL de álcool a 100%. Limpe 3 vezes por 2 min cada em 200 mL de xileno ou um substituto do xileno. Monte em um meio de montagem baseada em xileno.</li>
	<li>Fotografar os slides (pelo menos dez campos na ampliação de 40x do septo interventricular de cada coração) e medir a densidade de área Pecam-1 usando o livremente disponível de software ImageJ 31. Usar o plugin de 32 de deconvolução de cor para DAB e hematoxilina e ajustar o contraste da imagem ao mesmo nível. 
	Nota: caso a cor marrom e roxo/azul tem sobreposição espectral significativa, o que pode causar dificuldades com deconvolução de cor, um poderia tentar diferentes marcas de solução de hematoxilina, para obter a coloração nuclear clara, luz-azul. Alternativamente, pode ser executada de imunofluorescência ou contagem manual dos capilares.</li>
</ol>

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	<li>Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+animals:+ethical+issues,+including+welfare+concerns.">Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns.</a> Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).</li><li>Karl, T., Pabst, R., von H&#246;rsten, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+mice+in+pharmacological+and+toxicological+research.">Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).</li><li>Phoon, C. K., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Imaging+in+Mice.">Cardiovascular Imaging in Mice.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).</li><li>Wagner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+beta+stimulation+induces+rapid+cardiac+growth+and+angiogenesis+via+direct+activation+of+calcineurin.">Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin.</a> Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).</li><li>Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+Conditional+Vascular-Specific+Overexpression+of+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Beta/Delta+Leads+to+Rapid+Cardiac+Hypertrophy.">Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy.</a> PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).</li><li>Ghanbarian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt2/Trdmt1+as+Mediator+of+RNA+Polymerase+II+Transcriptional+Activity+in+Cardiac+Growth.">Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth.</a> PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).</li><li>Meguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporine+attenuates+pressure-overload+hypertrophy+in+mice+while+enhancing+susceptibility+to+decompensation+and+heart+failure.">Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure.</a> Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).</li><li>de Ara&#250;jo, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+and+moderate+aerobic+training+before+allergic+asthma+induction+reduces+lung+inflammation+and+remodeling.">Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling.</a> Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).</li><li>Benavides-Vallve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+for+echocardiographic+evaluation+of+left+ventricular+function+in+a+mouse+model+of+long-term+myocardial+infarction.">New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction.</a> PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).</li><li>Colazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+left+atrium+and+left+atrial+appendage+structure+and+function:+echocardiographic+and+morphologic+evaluation.">Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation.</a> PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).</li><li>Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+anesthetics+for+assessing+left+ventricular+systolic+function+by+echocardiography+in+mice.">Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).</li><li>Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echocardiography+in+Mice.">Echocardiography in Mice.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).</li><li>Mor-Avi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+evolving+echocardiographic+techniques+for+the+quantitative+evaluation+of+cardiac+mechanics:+ASE/EAE+consensus+statement+on+methodology+and+indications+endorsed+by+the+Japanese+Society+of+Echocardiography.">Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography.</a> J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).</li><li>Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+echocardiography+for+the+phenotypic+assessment+of+genetically+altered+mice.">Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice.</a> Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).</li><li>Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echocardiographic+evaluation+of+ventricular+function+in+mice.">Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice.</a> Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).</li><li>Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+avertin+versus+xylazine-ketamine+anesthesia+on+cardiac+function+in+normal+mice.">Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).</li><li>Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+echocardiography+in+the+assessment+of+cardiac+physiology+and+disease+in+preclinical+models.">High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models.</a> Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).</li><li>Fayssoil, A., Tournoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+left+ventricular+function+in+mice+with+Doppler+echocardiography.">Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography.</a> Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).</li><li>Schoensiegel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+echocardiography+in+conscious+mice:+training+and+primary+screens.">High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens.</a> Ultraschall Med. 32, S124-S129 (2011).</li><li>Yariswamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-restricted+Overexpression+of+TRAF3+Interacting+Protein+2+(TRAF3IP2)+Results+in+Spontaneous+Development+of+Myocardial+Hypertrophy,+Fibrosis,+and+Dysfunction.">Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction.</a> J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).</li><li>Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-Specific+Disruption+of+GH+Receptor+Alters+Glucose+Homeostasis+While+Maintaining+Normal+Cardiac+Performance+in+Adult+Male+Mice.">Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice.</a> Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).</li><li>Kerr, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+function+of+adult+vasculature+is+sustained+by+Akt/Jagged1+signalling+axis+in+endothelium.">Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium.</a> Nat Commun. 7, 10960 (2016).</li><li>Wagner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+vessel+development+requires+activation+of+the+TrkB+neurotrophin+receptor+by+the+Wilms'+tumor+transcription+factor+Wt1.">Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1.</a> Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).</li><li>Wagner, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms'+tumour+suppressor+Wt1+is+a+major+regulator+of+tumour+angiogenesis+and+progression.">The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression.</a> Nat Commun. 5, 5852 (2014).</li><li>Yang, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+conscious+and+anesthetized+mice.">Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice.</a> Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).</li><li>Rottman, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+ventricular+function+assessed+echocardiographically+in+conscious+and+anesthetized+mice.">Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice.</a> J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).</li><li>Qui&#241;ones, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+quantification+of+Doppler+echocardiography:+a+report+from+the+Doppler+Quantification+Task+Force+of+the+Nomenclature+and+Standards+Committee+of+the+American+Society+of+Echocardiography.">Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography.</a> J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).</li><li>van Laake, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cell+therapy+and+assessment+of+cardiac+function+using+magnetic+resonance+imaging+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).</li><li>Wagner, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms'+tumor+suppressor+Wt1+is+expressed+in+the+coronary+vasculature+after+myocardial+infarction.">The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction.</a> FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).</li><li>Wagner, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+induction+and+inheritance+of+epigenetic+cardiac+hypertrophy+in+the+mouse.">RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse.</a> Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+histochemical+staining+by+color+deconvolution.">Quantification of histochemical staining by color deconvolution.</a> Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).</li><li>Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Left+Ventricular+Hypertrophy+to+Dysfunction+and+Failure.">From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure.</a> Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).</li><li>Ismail, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistologic+labeling+of+murine+endothelium.">Immunohistologic labeling of murine endothelium.</a> Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).</li><li>Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Griffonia+simplicifolia+isolectin+B4+identifies+a+specific+subpopulation+of+angiogenic+blood+vessels+following+contusive+spinal+cord+injury+in+the+adult+mouse.">Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse.</a> J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).</li><li>Ayoub, A. E., Salm, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+morphological+diversity+of+microglia+in+the+activated+hypothalamic+supraoptic+nucleus.">Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus.</a> J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).</li><li>Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+macrophages+express+a+new+glycoprotein+receptor+reactive+with+Griffonia+simplicifolia+I-B4+isolectin.">Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Diferentes métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a estrutura cardíaca e função em ratos, incluindo ecocardiografia avançada contraste MRI, micro CT e PET-scan. Devido à sua relação custo-eficácia e simplicidade, a Ecocardiografia é a técnica mais amplamente utilizada para a análise funcional em ratos11. Em geral, por causa do pequeno tamanho do coração e a alta frequência da frequência cardíaca em ratos, Transdutores com frequência &#62; MHz 10 deve ser usado, embora medi?...

Uma grande variedade de modelos de rato geneticamente modificados estão disponíveis, e o número de estudos farmacológicos em camundongos é alta1,2. Ecocardiograma e ressonância magnética são abordagens comumente usadas para a caracterização fenotípica da função cardíaca e morfologia nestes modelos de rato3. O objectivo do protocolo apresentado é analisar a função cardíaca e morfologia em ratos adultos. Ele combina ecocardiográfica, histológicos e medições de imuno-histoquímica. Exame ecocardiográfico é amplamente utilizado em ratos4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al 11 identificado 205 estudos publicados em circulação, Circulação pesquisa, American Journal of Physiology - coração e fisiologia do sistema circulatórioe Cardiovascular Research entre 2012 e 2015 que usado o exame ecocardiográfico em animais.
Ecocardiografia é usada para identificar fenótipos cardíacos em ratos geneticamente modificados5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, bem como para analisar a função cardíaca em hipertrofia induzida por sobrecarga crônica, isquemia miocárdica e modelos de cardiomiopatia em camundongos (revistos em12). Equipamento de ecocardiografia melhorado permite a medida padrão de imagem Doppler tecido ventricular esquerda dimensões de pressão sistólica e diastólica (LV), ecografia de contraste miocárdico e a avaliação da função regional de LV e reserva coronariana 12. idealmente, exame ecocardiográfico deve ser executada em ratos conscientes para evitar os efeitos negativos da anestesia na função contrátil, controle reflexo autonômico, e11a taxa de coração. No entanto, essa abordagem é limitada pela exigência de treinar os animais; dificuldades em manter a temperatura do corpo estável; artefatos de movimento; estresse; frequências cardíacas muito altas; e a exigência de pelo menos dois investigadores realizar o experimento, especialmente se um grande número de animais que estão sob investigação. Curiosamente, um estudo recente relatou não há diferenças em parâmetros ecocardiográficos em animais treinados e destreinados19. Realizamos medições ecocardiográficas em ratos anestesiados. Protocolos de anestesia diferente serão discutidos abaixo.
Apesar de ecocardiografia de resolução padrão (&#62; 10 MHz) é suficiente para medir LV sistólica e diastólica dimensões e função cardíaca em ratos adultos, o método é limitado em sua descrição de fenômenos estruturais subjacentes. Assim, aliamos as medições na vivo com histológicos e reagidos análises para medir, por exemplo, casos de diâmetro e embarcação de densidade. Outras investigações histológicas e reagidos, tais como a determinação de proliferação, exame de apoptose, medições de tamanho do infarto, determinação de fibrose e a expressão do marcador específico, também podem ser executadas no mesmo tipo de tratados de tecido, mas não são objecto do presente protocolo. A combinação de na vivo exame ecocardiográfico com análise histológica fornece insights adicionais sobre alterações estruturais subjacentes. Em uma etapa adicional, podemos completar estas medições com investigações ultra estruturais e moleculares. Análise histológica não só completa o exame ecocardiográfico, mas também tornar-se indispensável quando a resolução da Ecocardiografia não é suficiente. Este é especialmente o caso em modelos de camundongos geneticamente modificados que são letal embrionário23,24.

<table><tbody><tr><td>Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine</td><td>Life Technologies, Molecular Probes</td><td>W849</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Vectorlabs</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td><td>Vectorlabs</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td><td>Vectorlabs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3&#039;-Diaminobenzidine tablets</td><td>Sigma</td><td>D4168</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pecam-1 (CD31) antibody</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linear ultrasound probe, L15-7io</td><td>Philips Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echocardiograph, IE33 xMATRIX</td><td>Philips Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope, Leica DMi8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Filterset DAPI</td><td>Leica</td><td>11525304</td><td></td></tr><tr><td>Filterset TxR</td><td>Leica</td><td>11525310</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider</td><td>Spot Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software</td><td>Spot Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Computer</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Large Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Fine Science Tools</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>Rodent shaver</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-0243</td><td></td></tr><tr><td>cassettes for paraffin embedding</td><td>Sakura</td><td>4155F</td><td></td></tr><tr><td>neutral buffered Formalin</td><td>Sakura</td><td>8727</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sakura</td><td>8733</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine TEK III</td><td>Sakura</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5</td><td>Sakura</td><td>5229</td><td></td></tr><tr><td>microtome blades,Accu-Edge S35</td><td>Sakura</td><td>4685</td><td></td></tr><tr><td>microscopy slides, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9533</td><td></td></tr><tr><td>cover slips, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>1408</td><td></td></tr><tr><td>slide boxes</td><td>Sakura</td><td>3958</td><td></td></tr><tr><td>eosine solution</td><td>Sakura</td><td>8703</td><td></td></tr><tr><td>hematoxyline solution</td><td>Sakura</td><td>8711</td><td></td></tr><tr><td>microtome, RM2125RT</td><td>Leica</td><td>720-1880 (VWR)</td><td></td></tr><tr><td>water bath, Leica HI1210</td><td>Leica</td><td>720-0113(VWR)</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>ACRO444220050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>staining glass dish</td><td>VWR</td><td>MARI4220004</td><td></td></tr><tr><td>staining jars</td><td>VWR</td><td>MARI4200005</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>9010-0012</td><td></td></tr><tr><td>DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3&amp;prime;-Diaminobenzidine tablets</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr></tbody></table>

echocardiographic and histological examination of cardiac morphology in the mouse

Um número crescente de modelos do rato geneticamente modificados tornou-se disponível nos últimos anos. Além disso, o número de estudos farmacológicos realizados em ratos é alto. Caracterização fenotípica destes modelos do rato também requer o exame da função cardíaca e morfologia. Ecocardiograma e ressonância magnética (MRI) são abordagens comumente usadas para caracterizar a função cardíaca e morfologia em camundongos. Ecocardiográfica e ressonância magnética equipamentos especializados para uso em pequenos roedores é caro e exige um espaço dedicado. Este protocolo descreve medidas cardíacas em ratos usando um sistema clínico ecocardiográfico com uma sonda vascular humano de 15 MHz. As medições são realizadas em ratos adultos anestesiados. Pelo menos três sequências de imagem são registradas e analisadas para cada animal no modo-M na exibição de eixo curto paraesternal. Depois, exame histológico cardíaco é executado, e diâmetros de casos são determinados em hematoxilina-eosina - ou germe de trigo aglutininas (WGA)-manchado de parafina. Densidade do navio é determinado morfometricamente depois immunostaining Pecam-1. O protocolo tem sido aplicados com sucesso para estudos farmacológicos e diferentes modelos de animais geneticamente sob condições de linha de base, bem como após o infarto do miocárdio experimental pela ligadura permanente do (de artéria coronária descendente anterior esquerda RAPAZ). Em nossa experiência, a investigação ecocardiográfica é limitada a animais anestesiados e é viável em ratos adultos, pesando pelo menos 25 g.

Na Figura 1, representante gravações ecocardiográficas demonstram a utilidade da ecocardiografia para identificar fenótipos cardíacos em camundongos geneticamente modificados. A diferença entre um mouse com função cardíaca normal (figura 1A) e um animal com uma dilatação do ventrículo esquerdo e função LV reduzida (figura 1B) pode ser facilmente identificada. A Figu...

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Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Exame ecocardiográfico é frequentemente usada em ratos. Aparelhos de ultra-som de alta resolução caro foram desenvolvidos para esta finalidade. Este protocolo descreve um procedimento ecocardiográfico acessível, combinado com análises morfométricas histológica para determinar a morfologia cardíaca.

Exame ecocardiográfico e histológico da morfologia cardíaca no Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

echocardiographic-histological-examination-cardiac-morphology

Research

JoVE Journal

Medicine

21.3K visualizações.  CNRS, INSERM, iBV. Exame ecocardiográfico é frequentemente usada em ratos. Aparelhos de ultra-som de alta resolução caro foram desenvolvidos para esta finalidade. Este protocolo descreve um procedimento ecocardiográfico acessível, combinado com análises morfométricas histológica para determinar a morfologia cardíaca.

Vídeo: Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Transthoracic Echocardiography in Mice

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene expression. Transgenic and gene targeting methods can be used to generate mice with altered cardiac size and function,1-3 and as a result, in vivo techniques are needed to evaluate their cardiac phenotype. Transthoracic echocardiography, pulse wave Doppler (PWD), and tissue Doppler imaging (TDI) can be used to provide dimensional measurements of the mouse heart and to quantify the degree of cardiac systolic and diastolic performance. Two-dimensional imaging is used to detect abnormal anatomy or movements of the left ventricle, whereas M-mode echo is used for quantification of cardiac dimensions and contractility.4,5 In addition, PWD is used to quantify localized velocity of turbulent flow,6 whereas TDI is used to measure the velocity of myocardial motion.7 Thus, transthoracic echocardiography offers a comprehensive method for the noninvasive evaluation of cardiac function in mice.

Transthoracic echocardiography offers a noninvasive method for the evaluation of cardiac function in mice. A combination of ultrasound and Doppler imaging modalities can be used to obtain dimensional measurements of the heart and intracardiac blood flow, which together provide an assessment of cardiac systolic and diastolic performance.

Ecocardiografia transtorácica em Ratos

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene ...

Medicina

Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging

Rodent models of cardiac pathophysiology represent a valuable research tool to investigate mechanism of disease as well as test new therapeutics.1 Echocardiography provides a powerful, non-invasive tool to serially assess cardiac morphometry and function in a living animal.2 However, using this technique on mice poses unique challenges owing to the small size and rapid heart rate of these animals.3 Until recently, few ultrasound systems were capable of performing quality echocardiography on mice, and those generally lacked the image resolution and frame rate necessary to obtain truly quantitative measurements. Newly released systems such as the VisualSonics Vevo2100 provide new tools for researchers to carefully and non-invasively investigate cardiac function in mice. This system generates high resolution images and provides analysis capabilities similar to those used with human patients. Although color Doppler has been available for over 30 years in humans, this valuable technology has only recently been possible in rodent ultrasound.4,5 Color Doppler has broad applications for echocardiography, including the ability to quickly assess flow directionality in vessels and through valves, and to rapidly identify valve regurgitation. Strain analysis is a critical advance that is utilized to quantitatively measure regional myocardial function.6 This technique has the potential to detect changes in pathology, or resolution of pathology, earlier than conventional techniques. Coupled with the addition of three-dimensional image reconstruction, volumetric assessment of whole-organs is possible, including visualization and assessment of cardiac and vascular structures. Murine-compatible contrast imaging can also allow for volumetric measurements and tissue perfusion assessment.

This video demonstrates use of a rail-mounted high-frequency ultrasound probe to perform echocardiography on an anesthetized mouse. The methods describe both conventional two-dimensional and M-mode measurements of cardiac function in addition to newer, more powerful tools such as color Doppler, strain analysis, as well as general and targeted contrast imaging.

Ecocardiografia murino e ultra-sonografia

Rodent models of cardiac pathophysiology represent a valuable research tool to investigate mechanism of disease as well as test new therapeutics.1  ...

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential therapies. Given the expense and time involved in creating animal models of disease, it is critical that researchers have tools to accurately assess phenotypic expression of disease. Right ventricular dysfunction is the major manifestation of pulmonary hypertension. Echocardiography is the mainstay of the noninvasive assessment of right ventricular function in rodent models and has the advantage of clear translation to humans in whom the same tool is used. Published echocardiography protocols in murine models of PAH are lacking.
In this article, we describe a protocol for assessing RV and pulmonary vascular function in a mouse model of PAH with a dominant negative BMPRII mutation; however, this protocol is applicable to any diseases affecting the pulmonary vasculature or right heart. We provide a detailed description of animal preparation, image acquisition and hemodynamic calculation of stroke volume, cardiac output and an estimate of pulmonary artery pressure.

This article provides a protocol for the echocardiographic assessment of right ventricular size and pulmonary hypertension in mice. Applications include phenotype determination and serial assessment in transgenic and toxin-induced mouse models of cardiomyopathy and pulmonary vascular disease.

Avaliação ecocardiográfica do coração direito em Ratos

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Biologia do Desenvolvimento

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe CHD died before adulthood, with the maximum mortality during the first week of life. Remarkable advances in surgical techniques, diagnostic approaches, and medical management have led to marked improvements in outcomes. To address the critical research needs of understanding congenital heart defects, murine models have provided an ideal research platform, as they have very similar heart anatomy to humans and short gestation rates. The combination of genetic engineering with high-throughput phenotyping tools has allowed for the replication and diagnosis of structural heart defects to further elucidate the molecular pathways behind CHDs. The use of noninvasive fetal echocardiography to screen the cardiac phenotypes in mouse models coupled with the high fidelity of Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) histopathology with three-dimensional (3D) reconstructions enables a detailed view into the anatomy of various congenital heart defects. This protocol outlines a complete workflow of these methods to obtain an accurate diagnosis of murine congenital heart defects. Applying this phenotyping protocol to model organisms will allow for accurate CHD diagnosis, yielding insights into the mechanisms of CHD. Identifying the underlying mechanisms of CHD provide opportunities for potential therapies and interventions.

This article details murine congenital heart disease (CHD) diagnostic methods using fetal echocardiography, necropsy, and Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) followed by three-dimensional (3D) reconstruction.

Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable noninvasive method is essential to assess real-time cardiac morphological and functional changes in animal models of heart disease. Transthoracic echocardiography represents an important tool for noninvasive assessment of cardiac structure and function2. Here we used a high-resolution ultrasound imaging system to monitor myocardial remodeling and heart failure progression over time in a mouse model of TAC. B-mode, M-mode, and Doppler imaging were used to precisely assess cardiac hypertrophy, ventricular dilatation, and functional deterioration in mice following TAC. Color and pulse wave (PW) Doppler imaging was used to noninvasively measure pressure gradient across the aortic constriction created by TAC and to assess transmitral blood flow in mice. Thus transthoracic echocardiographic imaging provides comprehensive noninvasive measurements of cardiac dimensions and function in mouse models of heart disease.

The goal of this protocol is to noninvasively assess cardiac structural and functional changes in a mouse model of heart disease created by transverse aortic constriction, using B- and M-mode echocardiography and color/pulse wave Doppler imaging.

Avaliação da morfológicas e funcionais cardíacas Mudanças no Modelo rato de Transverse aórtica constrição por ecocardiográfica de imagem

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in rodents, with detailed descriptions of the appropriate methods for anesthesia, the echocardiographic windows used, the imaging planes and probe orientations for image acquisition, the methods for data analysis, and the limitations of emerging technologies for the evaluation of cardiac and valvular function. Importantly, we also highlight several future areas of research in cardiac and heart valve imaging that may be leveraged to gain insights into the pathogenesis of valve disease in preclinical animal models. We propose that using a systematic approach to evaluating cardiac and heart valve function in mice can result in more robust and reproducible data, as well as facilitate the discovery of previously underappreciated phenotypes in genetically-altered and/or physiologically-stressed mice.

This protocol provides a detailed description of the echocardiographic approach for comprehensive phenotyping of heart and heart valve function in mice.

Abordagens ecocardiograma e protocolos de Comprehensive Caracterização fenotípica de doença cardíaca valvular em ratos

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Murine Echocardiography of Left Atrium, Aorta, and Pulmonary Artery

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic pressure through echocardiography, as well as to obtain measurements of the Aorta and PA diameter in mice.
Mice older than 10 d of age can be analyzed using the present technique. The technique is composed of 3 main steps: set-up, image acquisition, and image analysis. The set-up step consists of getting the mouse anesthetized with 1% isoflurane, shaving it, and taping it in a supine position to a heated EKG board where the image acquisition will take place. The image acquisition step consists of learning to identify the cardiac structures and obtaining all the required images with its correspondent probe and axis in order to be able to calculate volumes and diameters. The image analysis step consists of measuring the previously acquired images with the aid of computer software.
Advantages of the proposed technique include a fast (15 min) procedure that would allow the researcher to evaluate interventions in a non-invasive, non-terminal approach and therefore follow the same mouse over time; each mouse can be used as its own control. This fact plus having the same operator perform all the acquisition and analysis for the entire experiment minimizes the limitation of operator-dependency. The present methodology is useful for mouse researchers in cardiovascular and pulmonary medicine.

The following protocol describes the methodology for the acquisition and analysis of echocardiographic images used to obtain the Left Atrial Volume (LAV), Aorta (Ao) diameter, and Pulmonary Artery (PA) diameter in mice. This technique is a non-invasive, non-terminal procedure that allows assessment of the cardiopulmonary function.

Murino Ecocardiografia de Esquerda Atrium, Aorta, ea artéria pulmonar

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

Mensuração ecocardiográfica dos parâmetros diastólicos do ventrículo direito no mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

Echocardiographic Characterization of Left Ventricular Structure, Function, and Coronary Flow in Neonate Mice

Echocardiography is a non-invasive procedure that enables the evaluation of structural and functional parameters in animal models of cardiovascular disease and is used to assess the impact of potential treatments in preclinical studies. Echocardiographic studies are usually conducted in young adult mice (i.e., 4-6 weeks of age). The evaluation of early neonatal cardiovascular function is not usually performed because of the small size of the mouse pups and the associated technical difficulties. One of the most important challenges is that the short length of the pups&#39; limbs prevents them from reaching the electrodes in the echocardiography platform. Body temperature is the other challenge, as pups are very susceptible to changes in temperature. Therefore, it is important to establish a practical guide for performing echocardiographic studies in small mouse pups to help researchers detect early pathological changes and study the progression of cardiovascular disease over time. The current work describes a protocol for performing echocardiography in mouse pups at the early age of 7 days old. The echocardiographic characterization of cardiac morphology, function, and coronary flow in neonatal mice is also described.

The present protocol describes the echocardiographic assessment of left ventricular morphology, function, and coronary blood flow in 7-day old neonate mice.

Caracterização ecocardiográfica da estrutura, função e fluxo coronariano do ventrículo esquerdo em camundongos recém-nascidos

Echocardiography is a non-invasive procedure that enables the evaluation of structural and functional parameters in animal models of cardiovascular ...