Modelos de transplante são ferramentas valiosas para pesquisas imunológicas que muitas vezes requerem experiência cirúrgica. Aqui, apresentamos uma abordagem viável para transplante de coração heterotópico e células musculares cardíacas em ratos. Ao destacar e simplificar todas as etapas cruciais do nosso modelo, os pesquisadores sem fundo cirúrgico devem ser capazes de dominar esse modelo em um período razoável de tempo.
Ambos os modelos de transplante fornecem insights valiosos sobre os mecanismos de tolerância e rejeição e podem ser aplicados em várias espécies. Temos muita experiência em ensinar esse modelo a indivíduos sem treinamento cirúrgico prévio. Depois de aprender os passos cruciais, aconselhamos paciência e prática suficiente com animais falecidos.
Para a explantação do coração do doador, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em animal doador de rato anestoizado de sete a 22 semanas, aplique lubrificante ocular e use cortadores mecânicos para remover a pele abdominal e torácica. Coloque o rato na posição supina em uma base de aquecimento e fixe os membros na base da mesa de operação com faixas elásticas. Desinfete a pele exposta com 70% de etanol e realize uma laparotomia mediana.
Insira retraídos na incisão e use cotonetes de algodão esterilizados para mobilizar o intestino para o lado esquerdo do doador para expor a veia cava inferior. Em seguida, puna a veia cava inferior para permitir a injeção intravenosa de 500 Unidades Internacionais de heparina dissolvida em um mililitro de solução salina isotônica gelada. Pare o sangramento no local perfurado após a retração da agulha por compressão leve usando um cotonete.
Incisar o diafragma, realizar uma toracotomia lateral em ambos os lados do doador e fixar a parede do tórax. Remova o pericárdio e o nervo vagal por preparação contundente usando dois porta-micro-agulhas. Para exsanguinação, transecte os vasos abdominais e insira o ramo contundente de uma tesoura apontada para a sonda no seio pericárdico transverso.
Use uma compressa para dissecar a aorta ascendente e a artéria pulmonar o mais distally possível sob tração caudal leve do coração. Coloque uma única ligadura 5-0 em torno da veia cava superior e inferior e das veias pulmonares e aperte a ligadura passo-sábio o mais dorsalmente possível. Corte o tecido dorsal à ligadura e extraia o coração.
Para perpreste o coração explantado, use uma cânula de 18 bitolas de um cateter intravenoso para lavar 30 mililitros de solução salina gelada e isotônica complementada com 1000 Unidades Internacionais de heparina através da aorta ascendente e da artéria pulmonar antes de colocar o coração em um tubo de solução salina de 15 mililitros no gelo. Depois de preparar o rato receptor de 10 a 14 semanas como apenas demonstrado, mobilize os intestinos para o lado superior esquerdo do receptor em uma compressa quente e molhada. E ajuste o microscópio cirúrgico ou uma alternativa suficiente.
Após a mobilização do duodeno e do jejunum proximal, respectivamente, utilizando uma ampliação completa de cinco a sete, use cotonetes de algodão e dissecção contundente para expor a aorta abdominal e a veia cava inferior. Usando dois micro-suportes de agulha para elevar os vasos abdominais sem ferir as veias lombares, coloque um grampo vascular cooley sobre os vasos. Use uma cânula de calibre 27 arqueada de 30 a 45 graus para perfurar os vasos abdominais.
E use a tesoura potts para ampliar o local da punção em uma incisão longitudinal que corresponde ao tamanho do lúmen dos vasos doadores. Para remover coágulos e prevenir trombose pós-operatória, perfumar os vasos com soro fisiológico e colocar o enxerto no situs. Usando dois simples interrompidos 8-0 monofiliamento suturas não resorbáveis, fixar o doador ascendente aorta à aorta abdominal receptora nos cantos craniano e caudal da incisão longitudinal.
Para anastomose a aorta ascendente do doador com a aorta abdominal do receptor coloque o enxerto à direita dos vasos receptores enquanto realiza a primeira metade da anastomose com uma corrida de 8-0 sutura de monofilamento. Em seguida, coloque o enxerto à esquerda dos vasos receptores e realize a segunda metade da anastomose. Fixar a artéria pulmonar do doador na veia cava inferior de forma semelhante com dois nós de canto nos cantos cranianos e caudais.
Depois de fixar o vaso doador com nós em cada canto, coloque um ponto de fora para dentro do vaso para executar uma anastomose intraluminal para a primeira metade da anastomose. Antes de amarrar a sutura, coloque outro ponto de dentro para fora. Para evitar embolia periférica após terminar a segunda metade da anastomose, lave a anastomose com soro fisiológico antes de apertar o nó da segunda metade da anastomose.
Coloque uma gaze hemostática em torno de ambos os anastomoses e solte cuidadosamente o grampo vascular Cooley para permitir a reperfusão do enxerto. Gerenciamento de qualquer sangramento com compressão leve e cotonetes de algodão esterilizados. Depois de cerca de 60 segundos, o coração deve começar a bater.
Substitua cuidadosamente os intestinos e feche a fáscia abdominal e a pele com suturas contínuas de polifilamento 3-0 separadas. No momento experimental apropriado, colde um coração de rato doador como demonstrado e use um bisturi estéril ou uma tesoura estéril para triturar o coração em fragmentos de três por três milímetros. Digerir as peças em 20 mililitros de cultura de meio suplementado com 0,5 miligramas por mililitro de colagenase por 30 minutos a 37 graus Celsius.
No final da digestão, adicione o tecido a uma peneira de grande porte, enquanto remove o meio de cultura. Adicione de cinco a 10 mililitros de solução salina isotônica e coe o chorume tecidual através da peneira. E depois de centrifugar a suspensão da célula duas vezes, filtre-a através de um filtro de célula de 40 micrômetros.
Enxágüe o coador com cinco a 10 mililitros de solução salina isotônica para coletar quaisquer células restantes. E após a centrifugação, resuspenque as células cardíacas isoladas de ratos em solução salina a uma concentração de cinco vezes 10 para as quintas células por mililitro. Carregue uma seringa de um mililitro com a solução celular e coloque o animal receptor anestesiado em uma posição lateral com a orelha alvo voltada para cima.
Fixar a orelha com um dedo e fita dupla face, e use uma cânula de 27 bitola para injetar subcutâneamente 20 microlitros de solução de célula muscular cardíaca perto dos vasos capilares visuais no ouvido do receptor. Após o período de observação experimental adequado, extraia os linfonodos cervicais drenantes e realiza as análises adequadas a jusante de interesse. Transplantes singênicos sobreviveram até 100 dias sem sinais de falha no enxerto.
A combinação específica doador-receptor pode resultar em diferentes velocidades de rejeição do transplante de coração heterotópico. Seções de criostatas dos corações rejeitados revelam um aumento da infiltração de células efeitos imunológicos, enquanto enxertos síngênicos estão em grande parte livres de células imunes. Linfodenectomia cervical e ensaios de re-estimulação de células de linfonodos drenantes após injeção de células musculares cardíacas orais revelam respostas imunes específicas de tensão distintas em direção ao tecido cardíaco heterotópico em receptores de transplante aogênicos, justificando novas análises imunológicas, como o perfil de citocina.
Manuseie os vasos cuidadosamente ao inserir e extrair a agulha. Não coloque muita atenção nas suturas para evitar estenose. Não coloque muitos pontos para cada anastomose.
