Este protocolo descreve um sistema genético reverso confiável e eficiente para a fabricação de rotavírus recombinantes. Também explica como fazer rotavírus recombinantes que expressam proteínas de marcadores fluorescentes. Este método é simples que requer um número mínimo de plasmídeos e pode gerar rotavírus recombinantes que expressam proteínas flúor separadas, bem como proteínas virais.
Comece semeando células BHKT7 em placas de 12 poços. Enxágüe uma monocamada recém-confluente de células com PBS. Em seguida, interrompa a monocamada com a solução trypsin-EDTA e resuspense as células em cinco mililitros de meio completo GMEM.
Determine a concentração de células BHKT7 viáveis usando azul trypan e um contador de células automatizado. Em seguida, semente duas vezes 10 para a quinta células em um mililitro de GMEM em cada poço de uma placa de cultura celular de 12 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% durante a noite.
No dia seguinte, prepare a mistura plasmida para transfecção de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, adicione 110 microliters de meio de soro reduzido pré-aquecido a cada mistura plasmida e delicadamente pipeta para cima e para baixo para misturar. Adicione 32 microliters de reagente de transfecção à mistura.
Faça uma breve centrifugação após o vórtice e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. Enquanto isso, enxágue as células BHKT7 com dois mililitros de meio incompleto GMEM. Adicione um mililitro de meio incompleto SMEM a cada poço e devolva a placa à incubadora.
Após a incubação de 20 minutos, use um pipettor de 200 microliteres para adicionar a mistura de transfecção gota a gota a cada poço. Balance suavemente o prato e devolva-o à incubadora. Dois dias após a transfecção, enxágue uma monocamada recém-confluente de células MA104 com PBS.
Interrompa a monocamada com a solução trypsin-EDTA e resuspense as células em cinco mililitros de meio completo DMEM. Conte as células e ajuste a concentração para oito vezes 10 para as quintas células por mililitro de meio incompleto de DMEM. Adicione 0,25 mililitros de células MA104 dropwise aos poços com as células BHKT7 transfectadas.
Ajuste a concentração de trippsina para 0,5 microgramas por mililitro adicionando 0,8 microliters a um miligrama por solução de estoque de trippsina de plonilitos para cada poço. Diluir as células MA104 restantes para uma concentração de 1,5 vezes 10 para as quintas células por mililitro em MMEM médio completo e colocar dois mililitros em cada poço de uma placa de seis poços. Seis dias após a transfecção, recupere o vírus recombinante das células transfeccionadas.
Sujeitar as células BHKT7 MA104 a três ciclos de congelamento/degelo em condições estéreis, movendo as placas entre um congelador negativo de 20 graus Celsius e temperatura ambiente. Transfira para tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos por 10 minutos a 500 vezes g e quatro graus Celsius para pelotar os detritos celulares.
Pegue o supernaspe e armazene-o a quatro graus Celsius. Adicione trippsina a 100 microliters de lise celular clarificada a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e incubar a mistura a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, prepare uma série de diluição serial de 10 vezes que varia de 10 a uma negativa a 10 para as sete negativas no meio incompleto do DMEM.
Enxágüe as monocamadas MA104 duas vezes com dois mililitros de PBS e uma vez com meio incompleto DMEM. Adicione 400 microliters de diluições de liseto em duplicação às placas e incuba-as a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, balançando a cada 10 a 15 minutos para redistribuir as diluições através da monocamada. Prepare uma solução de sobreposição mem agarose combinando volumes iguais de EMEM 2X pré-aquecido com 1,5% de derretimento e resfriada.
Mantenha esta solução a 42 graus Celsius em um banho de água e ajuste a concentração de trippsina para 0,5 microgramas por mililitro imediatamente antes de colocá-la nas células. Diluições de lise aspirada da placa de seis poços. Em seguida, enxágue as células uma vez com dois mililitros de meio incompleto.
Adicione suavemente três mililitros da solução de sobreposição de MEM agarose na monocamada de célula em cada poço. Deixe a agarose endurecer à temperatura ambiente. Em seguida, devolva as placas para a incubadora.
Três dias depois, prepare uma solução de sobreposição de MEM agarose como descrito anteriormente e adicione vermelho neutro a uma concentração final de 50 microgramas por mililitro imediatamente antes do uso. Adicione dois mililitros da solução de sobreposição em cima da agarose existente nas placas de seis poços. Deixe a agarose endurecer e retornar a placa para a incubadora, certificando-se de proteger as placas com vermelho neutro da luz.
Nas próximas seis horas, identifique placas de rotavírus com o auxílio de uma caixa de luz. Use pipetas de transferência descartáveis para escolher placas claramente definidas, recuperando plugues de ágarose que se estendem totalmente à camada celular. Expele o plugue em um tubo de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de meio incompleto de DMEM e vórtice da amostra por 30 segundos.
Amplifique o vírus isolado da placa eludida para o meio por propagação em monocamadas MA104 ou frasco AT25 com mMEM médio incompleto e 0,5 microgramas por mililitro de trippsina. Adicione 600 microliters de lises celulares infectadas e 400 microliters de tiocianato de guanidinium em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Vórtice-los por 30 segundos e incuba-los à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio. Vórtice a solução por 30 segundos e incuba-a por três minutos. Após uma microcentrifugação de cinco minutos a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius, transfira 550 microliters da fase aquosa superior em um tubo fresco.
Adicione dois volumes de álcool isopropílico frio e inverta o tubo de quatro a seis vezes. Incubar a amostra em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, centrifuá-lo por 10 minutos a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius.
Descarte o supernatante deixando a pelota de RNA. Lave o RNA adicionando um mililitro de 75% de etanol ao tubo invertendo-o uma vez e centrifugando-o por cinco minutos a 7.500 vezes g e quatro graus Celsius. Depois de remover cuidadosamente o etanol, deixe o RNA secar por cinco a 10 minutos.
Em seguida, dissolva a pelota em 15 microliters de água livre nuclease. Adicione dois microliters de 6X buffer de carregamento de DNA a 10 microliters da amostra de RNA dissolvida. Carregue-o em um mini gel pré-lançado de 10%.
Resolva os RNAs por eletroforrese no buffer de execução tris-glicina por duas horas sob uma corrente constante de 16 miliamperes. Uma vez que a corrida de gel esteja completa, mergulhe o gel por cinco a 10 minutos em água contendo um micrograma por brometo de etídio mililitro e detecte os segmentos do genoma rotavírus com um transilluminator UV. Este protocolo de genética reversa foi usado para gerar vírus SA11 recombinantes que podem ser facilmente identificados com um ensaio de placa em células MA104 permitindo o isolamento da placa.
Os genomas dsRNA de placa purificado rSA11 tipo selvagem e vírus SA11-UnaG foram extraídos com uma solução contendo fenol e tiocianato de guanidinium, resolvido por eletroforrese em um gel de 10% poliacrilamida e detectado por coloração com brometo de enétnico. Como esperado, o segmento sete ou NSP3 dsRNA de rSA11-UnaG migrou muito mais lento do que o do tipo selvagem rSA11 devido à presença de sequências 2A-3xFLUnaG. Para verificar a expressão da proteína fluorescente UnaG, as células MA104 foram infectadas com tipo selvagem e vírus recombinante e examinadas com um imager de células vivas.
A análise mostrou que o rSA11-UnaG produziu fluorescência verde enquanto nenhuma fluorescência foi detectada em células infectadas com o tipo selvagem rSA11. A análise do imunobloto foi realizada para investigar se o elemento 2A do rSA11-NSP3-2A-xflUnaG promoveu a expressão de duas proteínas separadas. A análise mostrou que nSp3-2A e 3xFL-UnaG foram de fato expressos como proteínas separadas indicando um elemento 2A funcional.
Para uma recuperação bem-sucedida do rotavírus recombinante, é fundamental usar células BHKT7 de qualidade e bem conservadas para transfecção e células MA104 para sobressar, bem como quantidades precisas de plasmídeos altamente puros. Embora este protocolo explique como usar o sistema de genética reversa para modificar o gene rotavírus NSP3, a mesma abordagem pode ser usada para modificar outros genes, como o SP1.
