Este Modelo de Doença In Vitro, pode ser usado para estudar a interação de células derivadas de sangue inteiro e paciente, especificamente a endotelial, para avaliar a trombogenicidade e a eficácia dos agentes anticoagulantes. Estas células de endotélio podem ser usadas em várias circunstâncias e podem ser modificadas introduzindo microfluidos personalizados ou ajustando parâmetros de fluxo sanguíneo. Além disso, este modelo pode ser usado para estudar a dinâmica do trombo em condições inflamatórias, ou para avaliar os efeitos da terapia anticoagulante e antiplaquelet.
Em última análise, essas abordagens podem ser usadas em um método de medicina personalizada. Depois de obter uma amostra cirúrgica de tecido arterial pulmonar humano, cubra a célula de alta afinidade com 60 mililitros de cultura celular com dois mililitros de cinco microgramas por mililitro fiboronectina e incubar o prato a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. No final da incubação, use fórceps estéreis em um armário de fluxo laminar em condições estéreis, para transferir o tecido para uma placa de Petri de PBS.
Se o tecido ainda estiver em um anel, corte a artéria aberta com uma tesoura, tomando cuidado para não tocar na camada mais interna do vaso, pois o endotélio é facilmente danificado e removido. Depois de remover a fibronectina, adicione quatro mililitros de meio completo de célula endotelial ao prato e use fórceps para transferir a amostra de tecido para o meio, use um bisturi para raspar cuidadosamente a camada interna do vaso no meio, tomando cuidado para evitar quaisquer acúmulos lipídicos que são observados na parede do vaso. Depois que as células tiverem sido colhidas, coloque a placa na incubadora de cultura celular.
Se os fibroblastos contaminarem a cultura, use a separação celular de afinidade magnética para um CD144, de acordo com as instruções do fabricante para purificar as células. Geralmente, a cultura é definida como pura, quando a citometria de fluxo detecta 10% ou menos células contaminantes. Quando o número suficiente de células endoteliais foram obtidas para uso experimental, as células endoteliais primárias podem ser caracterizadas pela presença de marcadores específicos de células endoteliais e pela ausência de marcadores musculares lisos e células epiteliais.
Para a preparação da câmara de fluxo, código um canal de um slide de fluxo de seis poços com 30 microliters de 0,1% de gelatina e incubar este slide por pelo menos 15 minutos a 37 graus Celsius. Além das câmaras de fluxo comerciais, câmaras de fluxo personalizadas com dimensões específicas podem ser usadas para estudar a influência da geometria vascular na dinâmica do coágulo. Enquanto o slide está incubando, coletar as células de uma cultura de células endoteliais confluentes da artéria pulmonar com EDTA e trypsin e sedimentos que células por centrifugação, suspender a pelota em 600 microliters de células endoteliais completas médias e vigorosamente, mas suavemente, adicionar 100 microliters de células em cada canal, adicionar um adicional de 50 microliters de células endoteliais completas ao meio do canal , para fornecer meio suficiente para incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, mude o meio no dia seguinte para lavar as células desvinculas.
Após seis dias na cultura, as células deveriam ter formado uma monocamada confluente estável. No sétimo dia da cultura das células endoteliais da artéria pulmonar, adquira amostras de sangue venoso de indivíduos que não recebem tratamento anticoagulativo em 109 tubos anticoagulantes de citrato monossódico e transfiram o sangue para um tubo de 50 mililitros. O sangue pode conter vírus e outros agentes infecciosos.
Por isso, é importante sempre usar luvas e seguir as orientações de segurança para trabalhar com material humano. Fluorescente rotulou os glóbulos com 1 a 10.000 de concentração de Calcein AM Red e 50 microgramas por mililitro e adicionar Alexa 488 fibrinogen, em seguida, incubar o sangue a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir a absorção completa. 30 minutos antes da perfusão, trate as células endoteliais da artéria pulmonar com 100 microliters de uma histamina micromolar em células endoteliais média e 1% soro bovino fetal sem quaisquer outros aditivos.
E use uma seringa de 20 mililitros cheia de tampão de lavagem para enxaguar os tubos do sistema de fluxo, carregue uma seringa de 3 a 20 mililitros com dois mililitros de tampão de lavagem e carregue a seringa em uma bomba de seringa. Use uma segunda seringa de 20 mililitros para encher os tubos de fluxo com hippies mais tampão contendo albumina de soro bovino de 1% e use um conector Laura em forma de cotovelo para conectar cuidadosamente os tubos ao micro slide, conecte a saída do slide à seringa, repare a partir de microscopia colocando a célula contendo slide no palco e montando a configuração para o experimento , ajuste o microscópio e defina os parâmetros para a imagem. Recalcificação de sangue enfático.
E este é um feliz co-patrocinador de coagulação, além disso tente evitar a formação de bolhas de ar porque isso danificará a camada celular endotelial e influenciará seus resultados. Imediatamente antes da perfusão, diluir o sangue em dois momentos com tampão de recalcificação e colocar o tubo de entrada do micro slide no tubo de sangue, pressione comece a bomba de seringa. Assim que o sangue começar a fluir sobre o endotélio, pressione o microscópio para adquirir imagens usando os canais ativos pré-selecionados e posições de região de interesse, a cada 15 segundos por cinco minutos.
No final da análise, pare a gravação e a bomba de seringa e limpe corretamente. A rotulagem de plaquetas com Calcein AM Red e a adição de Fibrinogen conjugado Alexa 488, permite a investigação da formação de trombos por aderência plaqueta e fibra e deposição. Em condições não estimuladas, não há vinculação de plaquetas ou fibrina ao endotélio.
A estimulação com histamina resulta em um aumento imediato na adesão plaqueta, que atinge um platô após 2,5 minutos, neste momento, as plaquetas começam a segregar fatores autocrinos que induzem uma agregação plaqueta e decote fibrinogênio à fibrinão, resultando em fibra e deposição em três minutos e a formação de um agregado estável com as plaquetas após quatro minutos. O tratamento com anticoagulante direto inibe a formação de coágulos e a adesão plaqueta em comparação com o sangue não tratado. A análise imunofluorescente das interações de plaquetas de células endoteliais da artéria pulmonar após cinco minutos de perfusão, revela a manutenção da célula endotelial, contatos celulares, conforme confirmado pela coloração da cadherina endotelial vascular, indicando que os coágulos sanguíneos se formam em camadas de modelo endotelial em vez da matriz subjacente entre as lacunas endoteliais.
as células endoteliais da veia umbilical humana demonstram menos adesão plaquetária e deposição fibrina em comparação com o endotélio da artéria pulmonar. Notavelmente, as células endotelias da artéria pulmonar primária doente de pacientes com hipertensão pulmonar tromboembólica crônica, apresentam uma adesão plaquetária aumentada e mais deposição de fibrina em comparação com células saudáveis. A trombogenicidade do endotélio depende de múltiplos fatores como a origem do leito vascular ou as partes de fundo biológico.
Utilizando este protocolo, disfunções intrínsecas em componentes vasculares e sanguíneos, bem como a eficácia da terapia anticoagulada podem ser testadas durante diferentes fases da hemostase trombose. Este protocolo pode ser usado para entender as interações de sangue e Theo, em várias doenças tromboembólicas com o potencial final de prever respostas específicas do paciente à terapia anticoagulação.
