A triagem de partículas transmitidas pelo ar sobre a citotoxicidade pulmonar aguda expondo células pulmonares humanas cultivadas no ALI usando este sistema de exposição in vitro pode ajudar a reduzir experimentos em animais. A principal vantagem deste sistema de exposição é o conceito de distribuição de aerossol radial que leva a uma distribuição homogênea e à posição das partículas sobre as células. Antes de semear as células, adicione 2,5 mililitros de meio de crescimento temperado a cada poço de uma placa de seis poços.
Coloque as pastilhas de cultura celular sem células cuidadosamente dentro dos poços e adicione um mililitro de meio de crescimento a cada inserção de cultura celular. Incubar as placas por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a experimentação das células, diluir 100 microliters da suspensão da cultura celular em um copo cheio de 10 mililitros de solução isotônica.
Incline o copo lentamente sem tremer. Em um contador celular, determine o número de células viáveis por mililitro e viabilidade celular com base nos parâmetros de medição específicos da célula das células A549. Após o tempero da placa, aspire o meio dentro das inserções da cultura celular e semente um mililitro de células A549 com uma densidade de três vezes 10 para as quintas células por mililitros em cada inserção de cultura celular.
Distribua a suspensão da célula por balanço suave e incubar por 24 horas. Defina o tempo de pressão através do controle de tempo na parte frontal da prensa. Abra o fornecimento de ar comprimido na válvula de ar comprimido.
Usando o regulador de pressão na parte frontal da prensa, coloque a pressão de ar comprimido em aproximadamente duas barras. Puxe a gaveta, pressione o botão Pressione e leia a pressão no interruptor de pressão digital. Encha o recipiente da substância com uma pequena quantidade da substância de ensaio.
Insira o êmbolo no recipiente da substância e gire-o ligeiramente para frente e para trás para distribuir uniformemente o pó no recipiente. Coloque o recipiente de substância, com o êmbolo, na gaveta e pressione o botão Pressione. Abra a gaveta e remova o êmbolo.
Um passo crítico é a prensagem de substâncias de teste que devem ser especificamente comprimidas a um bolo de pó dentro do recipiente de substâncias, a fim de permitir exposições estáveis de partículas. Remova o adaptador de entrada e o refletor de condensado do módulo norteador do aerossol. Feche os três furos de alimentação de aerossol no módulo norteador de aerossol com plugues e as conexões médias de alimentação no módulo de amostragem com retalhos falsos.
Conecte as linhas de vácuo com o conector do tubo do módulo norteador do aerossol. Use a roda de mão para fechar o módulo e medir o valor dos controladores de fluxo. Alguns minutos após o fechamento, os valores diminuem abaixo de cinco mililitros por minuto.
Inicie o software do gerador de aerossol. Se o raspador de substância não estiver na posição mais baixa, pressione o modo homing do botão. Coloque o recipiente de substância com o material de ensaio prensado de cabeça para baixo sobre o raspador de substância.
Certifique-se de que o vidro do recipiente de substância está de frente para a frente. Coloque a placa de bloqueio na ranhura sobre o recipiente da substância e aperte o parafuso preto. Altere os valores para Alimentação e Rotação para as configurações desejadas.
Use as setas para baixo para empurrar para baixo o slide com o recipiente de substância até que o raspador de substância esteja perto da substância prensada. Abra a fonte de ar comprimido para o gerador de aerossol com um toque do controlador de fluxo de massa e inicie a geração de aerossol clicando no botão Iniciar. Defina a taxa de alimentação para 15 a 20 milímetros por hora para evitar longos tempos de espera.
Controle a geração correta de partículas observando a nuvem de poeira fina com uma pequena lanterna posicionada por baixo atrás do tubo de vidro do elutriador. Inicie a oferta média com meio de exposição pré-aquecido e preencha os módulos de amostragem até que os tubos de aduques estejam cobertos enquanto o módulo estiver aberto. Insira inserções de cultura de células cegas no módulo de exposição, bombeie o meio de exposição para baixo até que os tubos de aposição estejam cobertos com meio e o lado inferior das pastilhas esteja em contato com o meio.
Inicie o gerador de aerossol, feche o módulo de exposição e conecte o módulo de exposição à saída do módulo de exposição do gerador de aerossol. 30 minutos após o tempo de chumbo, sele a saída do módulo de exposição do elutriador com um plugue de borracha e remova as pastilhas cegas. Reabastecer o meio de exposição até que os tubos de adus estejam cobertos com meio.
Remova as pastilhas de cultura celular das seis placas do poço com a ajuda de pinças. Despeje o meio de crescimento cuidadosamente da cultura celular, derrubando as pastilhas e use uma pipeta para aspirar e descartar o líquido residual. Coloque as pastilhas nas câmaras de exposição dos módulos de exposição e ar limpo.
Feche os módulos e inicie os experimentos de exposição conectando o módulo de exposição à saída do módulo de exposição do gerador de aerossol e ao módulo de ar limpo ao fornecimento de gás transportador simultaneamente. Após a conclusão do experimento, desconecte os módulos de exposição e ar limpo e sele a saída do módulo de exposição. Pare a fonte de ar comprimido e o gerador de aerossol clicando no botão Parar.
Abra o módulo de exposição e ar limpo e use pinças para transferir as pastilhas de cultura celular para as seis placas de poço preparadas pós-incubação. Incubar as seis placas do poço, bem como as pastilhas de cultura celular não expostas, por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na interface líquida de ar. 24 horas após a exposição, insira as pastilhas de cultura celular nas novas seis placas de poço preparadas.
Adicione um mililitro da solução WST1 preparada recentemente para cada inserção de cultura celular. Balance as placas cuidadosamente para distribuir a solução de forma homogênea nas células. Incubar as seis placas do poço com as pastilhas de cultura celular por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Depois disso, transfira 100 microliters do supernatante em triplicados de cada placa de seis poços para uma placa de 96 poços. Usando um leitor de microplaca, meça a absorvância em 450 nanômetros com um comprimento de onda de referência de 650 nanômetros. O CULTEX RFS é um sistema de exposição in vitro modular especialmente projetado que permite a exposição direta e homogênea das células às partículas transmitidas pelo ar na interface líquida do ar.
A exposição das células ao ar limpo não leva a nenhuma diminuição da viabilidade celular ao longo do tempo. O sistema de exposição foi validado com sucesso e estabelecido como um modelo de previsão para os riscos agudos de inalação dos compostos testados. Exposição de células A549 a diferentes substâncias de teste que não apresentaram toxicidade, média ou forte.
Por favor, certifique-se de manter estritamente os períodos de tempo que são os tempos de incubação, o tempo de chumbo da geração de partículas e os tempos de deposição de partículas. Este método de exposição é projetado principalmente para a exposição de partículas das células, mas pode ser estendido à exposição de aerossóis líquidos e gases por meio da adaptação do método de geração de aerossol. Este método de triagem permite a avaliação qualitativa de partículas inaláveis em relação à toxicidade aguda da inalação in vitro, reduzindo assim os testes em animais que normalmente forneceriam essa avaliação toxicológica.
Não se esqueça que trabalhar com substâncias tóxicas de teste pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar luvas, uma máscara, devem ser sempre tomadas ao manusear tais compostos.
