A imagem de Bdellovibrio bacteriovorus de células vivas tem sido desafiadora devido ao complexo ciclo de vida dessas bactérias predatórias. Nosso protocolo permite o monitoramento das etapas do ciclo de vida completo em tempo real. Embora nosso protocolo seja baseado em cepas específicas de equalização, ele pode ser facilmente adaptado a uma variedade de cepas bacterianas, incluindo cepas patogênicas.
Para criar uma cultura B.bacteriovorus, combine um mililitro de bactérias cultivadas frescas 24 horas com três mililitros de cultura de presas durante a noite em um frasco de 250 mililitros contendo 50 mililitros de hippies de cálcio protegidos com antibióticos conforme necessário. Após uma incubação de 24 horas a 30 graus Celsius e 200 revoluções por minuto, verifique se as células presas foram totalmente lised por microscopia de contraste facial montada líquida. Numerosas células B.bacteriovorus em fases multi-ataque devem estar presentes e nenhuma célula E.coli ou bdelloplast deve ser visível.
Coe a cultura B.bacteriovorus através de um filtro de tamanho de poros de 0,45 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros e suspenda o filtrado em uma centrífuga. Em seguida, suspenda novamente a pelota B.bacteriovorus em três mililitros de tampão hippies de cálcio para uma densidade óptica final a 600 nanômetros de aproximadamente 0,2 e incubar as bactérias a 30 graus celsius e 200 revoluções por minuto durante 30 minutos. Para preparar as células hospedeiras, selecione uma única colônia da cepa hospedeira de interesse e para acenar com as bactérias em 10 mililitros de YT médio suplementados com antibióticos, conforme necessário para uma incubação noturna a 37 graus Celsius e 180 revoluções por minuto.
Na manhã seguinte, transfira dois mililitros da cultura da noite para um tubo de ensaio de dois mililitros e pelota as células por centrifugação. Em seguida, suspender novamente a pelota em 200 microliters de tampão hippies de cálcio. É muito importante suspender totalmente toda a pelota celular após a centrifugação para garantir que a célula presa esteja separada ao nível de célula única.
Para preparar as células para microscopia de fluorescência de lapso de tempo, primeiro, misture 200 miligramas de baixa agarose de grau molecular fluorescente com 20 mililitros de tampão hippies de cálcio e dissolva a agarose em um micro-ondas. Despeje três mililitros da agarose derretida em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros e deixe a agarose solidificar. Usando uma micro espátula de laboratório, remova cuidadosamente a almofada de agarose da placa sem perturbar o polo central da almofada e coloque o lado inferior da almofada para cima em uma tampa de placa de Petri.
Coloque cinco microliters da suspensão concentrada da célula hospedeira sobre a almofada virada e use um laço de inoculação para espalhar células no polo central. Em seguida, adicione cinco microliters da suspensão concentrada de B.bacteriovorus na superfície revestida de célula hospedeira sem se espalhar e retorne rapidamente o gel para o lado superior do prato de vidro de 35 mililitros para baixo. Em seguida, cubra o prato com uma tampa.
Para a microscopia de Floresnce time-lapse da co-cultura, coloque a placa em um suporte de placa de Petri de tal forma que a placa não se mova ao longo do experimento e coloque uma gota de óleo de imersão no objetivo do microscópio invertido e uma gota na parte inferior do prato. Monte o suporte no estágio do microscópio dentro da câmara de microscópio invertido e no software do microscópio defina a ampliação para 100X e a lente policromada para GFP e Mcherry. Usando um iPS em Brightfield, localize o plano focal e abra o gerente inútil.
Mova o palco e use o botão de pontos de marca para armazenar as coordenadas de pelo menos 10 posições de interesse. Troque a câmera val do iPS para o monitor. Defina o plano focal e clique no botão de ponto de substituição no inútil para o gerente calibrar cada ponto.
Abra o designer de experimentos e a caixa de empilhamento de doenças sem identificação. Selecione os canais fluorescentes apropriados e as configurações de eliminação ideais e defina os intervalos entre a aquisição da imagem e o tempo total do experimento. Habilite a manutenção do foco para as posições escolhidas e selecione a pasta de dados na qual os arquivos de imagem devem ser salvos automaticamente.
Verifique novamente todas as configurações do controle de software de microscópio e inicie o experimento de lapso de tempo. Após a primeira hora do experimento, verifique se todas as posições do palco ainda estão em foco. Quando o experimento de lapso de tempo estiver concluído, remova a placa de Petri e descarte a placa de 35 milímetros com uma almofada de agarose de acordo com os protocolos de biosegurança apropriados.
Para o processamento dos dados de imagem de lapso de tempo, transfira os dados experimentais para um computador carregado com o software Fiji e abra uma imagem em Fiji. Em opções de importação de bioformiamentos, selecione pilha de visualização com hyperstack. No modo de cor composta, selecione escala automática.
Ao percorrer as pilhas de imagens, avalie se as células e os bdelloplastos permaneceram focados ao longo do experimento. Se as manchas verdes fluorescentes do DNA e do verde mNeon estão presentes dentro das células B.bacteriovorus dentro dos bdelloplastos durante toda a fase de crescimento e se todas as etapas do ciclo de vida predatório podem ser visualizadas. Para analisar um bdelloplast celular B.bacteriovorus em particular, use uma ferramenta de seleção para marcar a célula de interesse.
Em seguida, duplique a região escolhida. Na imagem duplicada, clique em processo e suave e para cada canal fluorescente, clique em imagem, cor, ferramentas de canais e selecione o canal de interesse. Em seguida, clique em imagem, ajuste e contraste de brilho para ajustar o brilho e o contraste da imagem em cada canal.
Para adicionar uma barra de escala, selecione analisar, ferramentas e barra de escala. Para adicionar um carimbo de tempo às imagens, clique em imagens, pilhas e carimbo de hora. Para salvar as imagens modificadas, selecione TIF.
Para salvar os dados como uma sequência de imagem, a AVI para produzir um filme ou PNG para salvar uma única imagem do quadro atual. Este sistema baseado em microscopia de fluorescência time-lapse permite o rastreamento em tempo real de células B.bacteriovorus individuais e fornece informações valiosas sobre cada estágio do complexo ciclo de vida predatório. A fusão de pillsy mCherry permite que toda a célula predatória seja rotulada na fase de ataque, bem como no estágio inicial da fase de crescimento.
A transição do ataque para a fase replicativa pode ser visualizada não apenas pela formação de bdelloplast hospedeiro, mas também pelo aparecimento do relisome. O replisome é montado no polo celular invasor e mais de um replisome pode ser observado dentro de um crescente filamento B.bacteriovorus à medida que a fase de reprodução progride. Depois que várias cópias do cromossomo são sintetizadas, a replicação é encerrada.
Finalmente, o filamento multinucleado sofre septação e as células progêneras são liberadas do bdelloplasto. As células B.bacteriovorus devem ser materiais o suficiente para procurar ativamente por suas presas e toda a densidade celular deve ser alta o suficiente para permitir o apego celular predatório. Esta plataforma pode ser útil em experimentos envolvendo patógenos resistentes a múltiplos medicamentos e para facilitar melhorias na engenharia genética do B.bacteriovorus como antibiótico vivo na medicina humana e veterinária.
