O ensaio flypub mede comportamentos desinibidos sob a influência de álcool. Facilitando assim o estudo mecanicista do transtorno do uso de álcool. O álcool é uma das drogas mais prontamente disponíveis e amplamente abusadas no mundo.
O mecanismo neurobiológico subjacente ao transtorno do uso de álcool, no entanto, é incompletamente compreendido. A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, tem sido amplamente usada para estudar os efeitos do etanol na euforia, locomoção, desinibição e sedação. Também é usado para estudar suas mudanças duradouras e duradouras no comportamento relevante para o vício, como tolerância, sensibilização e busca de etanol.
Muitos estudos em Drosophila e outros modelos animais focam nos efeitos de ativação locomotor do etanol. O efeito distinto do etanol é a desinibição comportamental. No entanto, seu estudo é um pouco sub-representado.
Para abordar esta questão-chave, desenvolvemos o ensaio Flypub para medir o comportamento desinibido sob a influência do etanol. Para montar a câmara Flypub, pegue uma garrafa redonda e corte sua porção inferior de uma marca de 25 mililitros com uma lâmina de barbear. Crie um buraco na marca de 50 mililitros usando um ferro de solda quente.
Este é o ponto de acesso onde as moscas serão introduzidas. Coloque uma malha redonda de 54 milímetros de diâmetro na marca de 75 milímetros e fixe-a usando cola quente. Posicione uma folha de plástico transparente de 70 milímetros de diâmetro na extremidade inferior aberta e fixe-a usando cola quente.
Para garantir que a bala de plástico esteja firmemente presa à parte inferior, pressione para baixo usando pesos. Colete moscas machos em um grupo de 33. Coloque-os na lateral de um frasco de comida.
Coloque-os em uma incubadora de 25 graus Celsius com pelo menos 50% de umidade relativa e uma luz de 12 horas, ciclo escuro de 12 horas por 2 dias antes da exposição ao etanol. Prepare a estação de ensaio Flypub ligando luzes, um computador e uma câmera para gravação de vídeo. Prepare seis bares para um conjunto de experimentos.
Rotulá-los com um número de um a seis. Introduza suavemente as moscas no pub usando um pequeno funil. Feche o bar usando uma fita.
Aclimate as moscas por 10 minutos. Durante a aclimatação, ajuste o foco da câmera e registre os últimos cinco minutos de aclimatação. Durante a aclimatação preparem almofadas de algodão para a entrega de etanol.
Corte uma almofada de algodão em quatro quadrantes iguais e, em seguida, corte os cantos para fazê-lo caber em uma placa de Petri. Adicione uma almofada de algodão a uma placa de Petri. Adicione um mililitro de 95% de etanol ao algodão.
Certifique-se de que a solução de etanol seja distribuída uniformemente em toda a área do bloco. Cubra rapidamente a placa de Petri com lenços de laboratório. Coloque cuidadosamente um etanol contendo placa de Petri sob cada pub.
Alinhe os bares no palco. Comece a gravar e inicie simultaneamente um temporizador. Registo até que as moscas parem de cortejar ou se mover.
Remova o etanol que contém placa de Petri quando mais de 90% das moscas estiverem sedadas. Transfira suavemente as moscas sedadas de volta para frascos de comida. Coloque-os de volta na incubadora.
Repita as etapas anteriores a cada 24 horas por seis dias consecutivos. Abra o vídeo usando um media player. Em seguida, marcar o número de homens envolvidos em atividades de namoro a cada 10 segundos.
As atividades de namoro para pontuação incluem extensão de asa unilateral: cadeia de namoro, círculo de namoro, dobra abdominal e montagem. São mostradas gravações representativas de comportamento de mosca. Durante a aclimatação onde os machos não mostram muita atividade.
Durante a primeira exposição onde os machos exibem namoro esporádico. E durante a sexta exposição onde os machos exibem atividade de namoro. Digite o número de machos exibindo namoro em um bloco de dez segundos.
Use o número máximo de machos cortejando em três blocos consecutivos de 10 segundos como um ponto de dados representativo. A média de 10 pontos de dados consecutivos com o maior valor representam o percentual de namoro entremale por pub. O tipo selvagem Canton-S apresenta atividades progressivamente aumentadas de namoro desinibido após repetida exposição ao etanol.
Isso representa sensibilização comportamental para o efeito de desinibição do etanol. Examinamos o papel da octopamina na sensibilização testando as moscas que não possuem tiramina beta-hidroxilase, T beta H, assim deficiente em octopamina. Como Canton-S, os mutantes T beta H mostraram respostas escaladas à exposição repetida ao etanol, mas em um nível reduzido.
Quando comparamos T beta H e Canton-S, observamos que os machos mutantes T beta H exibiam um namoro menos desinibido do que os machos de Cantão-S em cada exposição indicando que a octopamina pode ser importante para a sensibilização. Agora você pode configurar, conduzir e analisar comportamentos induzidos pelo etanol usando o ensaio flypub. Os pontos-chave a ter em mente incluem, um, a montagem adequada do pub.
Duas, entrega consistente de etanol, e três, pontuação comportamental precisa e imparcial. O ensaio flypub tem muitas vantagens. É simples, barato de configurar, e fácil de aprender.
Além disso, vários grupos de moscas podem ser avaliados simultaneamente, facilitando este estudo para identificar os efeitos das manipulações genéticas ou experimentais. O ensaio flypub é altamente atrativo para experimentadores em todos os níveis, incluindo ensino fundamental até o ensino médio, estudantes de graduação e pós-graduação, pós-doutores e professores. Em resumo, o ensaio flypub permitirá identificar jogadores moleculares, vias celulares, circuitos cerebrais e fatores de risco que contribuem para o transtorno do uso de álcool.
