Il saggio Flypub misura comportamenti disinibiti sotto l'influenza dell'alcol. Facilitando così lo studio meccanicistico del disturbo da uso di alcol. L'alcol è una delle droghe più facilmente disponibili e ampiamente abusate al mondo.
Il meccanismo neurobiologico alla base del disturbo da uso di alcol, tuttavia, è incompleto compreso. La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è stata ampiamente utilizzata per studiare gli effetti dell'etanolo sull'euforia, la locomozione, la disinibizione e la sedazione. È anche usato per studiare i suoi cambiamenti lunghi e duraturi nel comportamento rilevanti per la dipendenza come tolleranza, sensibilizzazione e ricerca di etanolo.
Molti studi sulla Drosophila e su altri modelli animali si concentrano sugli effetti attivatori locomotori dell'etanolo. L'effetto distinto dell'etanolo è la disinibizione comportamentale. Tuttavia, il suo studio è piuttosto sottorappresentato.
Per affrontare questo problema chiave, abbiamo sviluppato il saggio Flypub per misurare il comportamento disinibito sotto l'influenza dell'etanolo. Per assemblare la camera Flypub, prendere una bottiglia rotonda e tagliare la parte inferiore di un segno da 25 millilitri con una lama di rasoio. Creare un foro al segno di 50 millilitri utilizzando un ferro da saldare a caldo.
Questo è il punto di accesso in cui verranno introdotte le mosche. Posizionare una rete rotonda di 54 millimetri di diametro al segno di 75 millilitri e fissarla utilizzando colla a caldo. Posizionare un foglio di plastica trasparente di 70 millimetri di diametro all'estremità inferiore aperta e fissarlo utilizzando la colla a caldo.
Per assicurarsi che il tondo di plastica sia saldamente attaccato al fondo, pressione verso il basso utilizzando pesi. Raccogli mosche maschili in un gruppo di 33. Posizionarli sul lato di una fiala alimentare.
Metterli in un incubatore di 25 gradi Celsius con almeno il 50% di umidità relativa e un ciclo buio di 12 ore, 12 ore per 2 giorni prima dell'esposizione all'etanolo. Preparare la stazione di dosaggio Flypub accendendo luci, un computer e una videocamera per la registrazione video. Prepara sei pub per una serie di esperimenti.
Etichettali con un numero da uno a sei. Introdurre delicatamente le mosche nel pub usando un piccolo imbuto. Chiudere il pub usando un nastro adesivo.
Acclimata le mosche per 10 minuti. Durante l'acclimatazione, regolare la messa a fuoco della fotocamera e registrare gli ultimi cinque minuti di acclimatazione. Durante l'acclimatazione preparare batuffoli di cotone per la consegna dell'etanolo.
Tagliare un batuffolo di cotone in quattro quadranti uguali e quindi tagliare gli angoli per adattarlo a una piastra di Petri. Aggiungere un batuffolo di cotone a una piastra di Petri. Aggiungere un millilitro di 95% di etanolo al batuffolo di cotone.
Assicurarsi che la soluzione di etanolo sia distribuita uniformemente su tutta l'area del pad. Coprire rapidamente la piastra di Petri con salviette da laboratorio. Posizionare con cura una piastra di Petri contenente etanolo sotto ogni pub.
Allineare i pub sul palco. Iniziare la registrazione e avviare contemporaneamente un timer. Registra fino a quando le mosche non smettono di corteggiare o muoversi.
Rimuovere l'etanolo contenente la piastra di Petri quando oltre il 90% delle mosche viene sedato. Trasferire delicatamente le mosche sedate di nuovo in fiale alimentari. Rimetterli nell'incubatrice.
Ripetere i passaggi precedenti ogni 24 ore per sei giorni consecutivi. Aprire il video utilizzando un lettore multimediale. Quindi segna il numero di maschi impegnati in attività di corteggiamento ogni 10 secondi.
Le attività di corteggiamento da segnare includono: estensione unilaterale dell'ala, catena di corteggiamento, cerchio di corteggiamento, piegatura addominale e montaggio. Sono mostrate registrazioni rappresentative del comportamento della mosca. Durante l'acclimatazione in cui i maschi non mostrano molta attività.
Durante la prima esposizione in cui i maschi mostrano un corteggiamento sporadico. E durante la sesta esposizione in cui i maschi mostrano corteggiamento di attività. Immettere il numero di maschi che visualizzano il corteggiamento in un blocco di dieci secondi.
Usa il numero massimo di maschi corteggiati in tre blocchi di tempo consecutivi di 10 secondi come punto dati rappresentativo. La media di 10 punti dati consecutivi con il valore più alto rappresenta la percentuale di corteggiamento intermale per pub. Il tipo selvatico Canton-S mostra un progressivo aumento delle attività di corteggiamento disinibito in caso di ripetuta esposizione all'etanolo.
Questo rappresenta la sensibilizzazione comportamentale all'effetto di disinibizione dell'etanolo. Abbiamo esaminato il ruolo dell'octopamina nella sensibilizzazione testando le mosche che mancano di tirammina beta-idrossilasi, T beta H, quindi carente di octopamina. Come canton-S, i mutanti T beta H mostrarono risposte crescenti alla ripetuta esposizione all'etanolo, ma ad un livello ridotto.
Quando abbiamo confrontato T beta H e Canton-S, abbiamo osservato che i maschi mutanti T beta H mostravano un corteggiamento meno disinibito rispetto ai maschi cantone-S in ogni esposizione indicando che l'octopamina può essere importante per la sensibilizzazione. Ora è possibile impostare, condurre e analizzare i comportamenti indotti dall'etanolo utilizzando il saggio Flypub. I punti chiave da tenere a mente includono, uno, un corretto assemblaggio del pub.
Due, consistente erogazione di etanolo, e tre, punteggio comportamentale preciso e imparziale. Il saggio Flypub ha molti vantaggi. È semplice, economico da configurare e facile da imparare.
Inoltre, più gruppi di mosche possono essere saggiati contemporaneamente, facilitando questo studio per identificare gli effetti delle manipolazioni genetiche o sperimentali. Il saggio Flypub è altamente attraebile dagli sperimentatori a tutti i livelli, comprese le scuole elementari, gli studenti universitari e laureati, i post-doc e la facoltà. In sintesi, il test Flypub ti permetterà di identificare giocatori molecolari, percorsi cellulari, circuiti cerebrali e fattori di rischio che contribuiscono al disturbo da uso di alcol.
