Uma abordagem simples foi tomada para monitorar as mudanças na proteostase, avaliando a agregação de poliglutamina e fornecendo uma estrutura que pode ser usada para aplicações de alto rendimento. Marcar um fenótipo como o número de agregados por eu posso me tornar subjetivo. Automatizar a contagem agregada nos permite eliminar esse viés, aumentar o throughput e a reprodutibilidade.
Este método ajuda a identificar genes bacterianos que contribuem para a interrupção da proteostase hospedeira. Compreender a contribuição de genes bacterianos individuais nos ajudará a entender sua implicação na patogênese de doenças como Alzheimer, Parkinson e Huntington. Comece removendo as placas contendo vermes do congelador e deixando-os descongelar em temperatura ambiente.
Em seguida, limpe o excesso de condensação e remova a tampa antes da imagem. Use as configurações do microscópio com tempo de exposição de 500 milissegundos, ampliação de 40 X com adaptador de câmera 0,63 X e intensidade GFP definida para 100% durante a captura de imagem. Agora ajuste os controles de luz transmitidos até que os vermes pareçam brilhantemente iluminados em comparação com o fundo escuro, evitando a superexposição.
Altere as posições dos vermes dentro do poço para evitar o desatoamento excessivo usando uma ponta de pipeta de 10 microliter para empurrar suavemente os vermes para a posição desejada. Defina o canal para o filtro GFP para estabelecer um plano focal para ambas as imagens. Capture uma imagem de campo brilhante.
Pegue uma imagem de fluorescência correspondente sem perturbar a placa ou mude o foco do microscópio. Agora, para avaliar as imagens, primeiro baixe o CellProfiler. Abra o software e arraste e solte as imagens de interesse na caixa de imagens.
Clique nas imagens na lista de arquivos para abri-las. Selecione o vidro da lupa para destacar uma região de interesse e o ícone de seta para medir o comprimento de ambos os worms e agregados. Passe o mouse sobre o objeto desejado para determinar seu valor de intensidade, que pode ser visto na parte inferior da tela.
Para utilizar o pipeline de análise de imagens CellProfiler, nomeie os pares de imagens corretamente conforme descrito no manuscrito do texto após o download do CellProfiler do site oficial. Baixe o pipeline e carregue-o no CellProfiler selecionando arquivo, importação e pipeline a partir de arquivos. Selecione o módulo de worms desemaranhados para abrir suas configurações para carregar um conjunto de treinamento usado para identificar worms no módulo de worms desemaranhados.
Em seguida, identifique o nome do arquivo do conjunto de treinamento. Selecione o ícone do arquivo de upload e carregue o arquivo suplementar também. Carregue imagens selecionando o módulo de imagens no canto superior esquerdo.
E, em seguida, arrastar e soltar imagens devidamente nomeadas. Antes de analisar as imagens, selecione a pasta de saída desejada que será usada para armazenar os resultados clicando no botão de configurações de saída localizado perto do canto inferior esquerdo do programa. Em seguida, selecione o ícone da pasta à direita da saída padrão para escolher o local de saída desejado.
Selecione o ícone de imagens de análise para iniciar a análise da imagem. Se a análise demorar muito para ser concluída e estiver presa ao processamento de uma única imagem, aborte a execução e identifique a imagem não processada, classificando-se através da pasta de saída e observando qual nome de imagem não é encontrado. Após a análise completa, o software organizará os resultados em uma planilha do Excel contendo worms individuais na coluna N e o respectivo número de agregados na coluna K.Baixe o organizador de metadados para organizar convenientemente os dados do arquivo CSV de saída do CellProfiler.
Para o Sistema operacional Windows, localize o arquivo baixado e extraia-o para o local desejado. Localize e abra a pasta extraída chamada gui_Windowsos_64x. E inicie o aplicativo clicando no ícone do aplicativo GUI.
Um prompt pode abrir solicitando permissão para executar. Selecione mais informações e clique em executar de qualquer maneira. O organizador de metadados está agora pronto para arrastar e soltar arquivos CSV de saída do CellProfiler.
Para o Mac OS, localize o arquivo baixado e extraia o arquivo do aplicativo organizador de metadados de arquivo. Abra a pasta extraída encontrada em downloads. Clique com o botão direito do mouse no aplicativo GUI e selecione aberto.
Um aviso aparecerá pedindo permissão para abrir devido à falta de uma licença oficial. Selecione aberto. Uma vez que o aplicativo organizador de metadados esteja aberto no respectivo SISTEMA OPERACIONAL, clique em carregar seus arquivos aqui ou arraste e solte os arquivos CSV desejados do CellProfiler.
Clique no botão organizar, que trará o usuário para uma nova tela com um botão de arquivos de download. Clique no botão e selecione o local desejado para salvar o arquivo de saída. O arquivo de saída aparecerá como o nome do arquivo original com _organized extensão adicionada ao nome do arquivo.
Na presença de FUDR, os vermes que foram alimentados com várias bactérias tinham um tamanho corporal mais consistente que permitia uma detecção mais uniforme e precisa de vermes, resolvendo assim o problema da superlotação. O congelamento dos worms melhorou a detecção de agregados de poliqu, eliminando a fluorescência de fundo, bem como a precisão da contagem automatizada comparável à contagem manual. A iluminação de campo brilhante invertida foi usada para detectar todo o canal C.elegans e GFP para imagem de agregados polyQ YFP.
A detecção, desembaraçar e quantificação agregada para cada worm foram feitas aplicando um pipeline otimizado de processamento de imagens CellProfiler, que permite obter o número de agregados por worm individual. A diferença entre a eficácia da quantificação agregada automatizada e usando o pipeline CellProfiler foi mínima, indicando que o método automatizado pode ser aplicado a telas de grande escala. Das 90 cepas bacterianas testadas, a colonização do intestino C.elegans com um candidato mostrou uma diminuição significativa no número de agregados.
Os experimentos de confirmação por contagem manual revelaram que nenhum dos mutantes, incluindo o que diminuiu significativamente o número de agregados afetou a agregação de polq. Os pesquisadores que decidirem usar esse quadro devem entender que as etapas traçadas não são absolutas. Modificações e uma compreensão fundamental de como manipular o CellProfiler são essenciais para o sucesso.
Abordagens bioquímicas adicionais, como a mancha ocidental, podem ser usadas para confirmar a agregação de polq.
