Os autores gostariam de reconhecer que esta pesquisa recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia para o projeto PATROLS, sob o acordo de subvenção nº 760813

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As aplicações para modelos hepáticos 3D variam consideravelmente dependendo do ponto final bioquímico específico ou da via de desfecho adverso que está sendo alvo. Cada modelo tem seus benefícios e limitações, desde a variação interdonor nos modelos primários de hepatócito humano (PHH) até a redução da atividade citocromática p450 em modelos baseados em linha celular, mas todos são valiosos por si só6,12,18,19. Ao avaliar a genotoxicidade, há limitações na compatibilidade dos modelos com pontos finais aprovados pela regulamentação, como o ensaio de micronuclear in vitro, pois a proliferação ativa é necessária. Isso é necessário, pois a avaliação da genotoxicidade requer a quantificação de danos fixos de DNA a serem avaliados na divisão pós-celular quando há oportunidade de reparação de DNA para corrigir lesões transitórias. Infelizmente, hepatocitos altamente diferenciados (ou seja, esferoides baseados em HepaRG) ou microtissues PHH, que são considerados como apresentar as características hepáticas mais fisiologicamente relevantes formam modelos estáticos (não proliferativos)12,19,20. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 3D apresentado aqui fornece um modelo adequado e alternativo capaz de suportar testes de genotoxicidade. Os esferoides baseados em linha celular HepG2 têm células divisórias suficientes na superfície externa dos esferoides, mantendo características básicas semelhantes ao fígado, como a produção de albumina e ureia e alguma atividade CYP4505,12,19. Principalmente este modelo hepático in vitro foi desenvolvido para complementar o ensaio micronucleus, pois este é um dos dois ensaios in vitro recomendados na bateria para testes de genotoxicidade8,10,11,21. No entanto, o modelo pode ser facilmente aplicado às tecnologias de análise de sequenciamento de DNA e expressão genética (RNA), enquanto tem o potencial de ser ainda mais adaptado e utilizado para outros pontos finais de dano de DNA, como o ensaio do cometa. No entanto, é importante considerar o papel que a interferência do ENM desempenha em algumas análises de ponto final. Por exemplo, análises baseadas em citometria de fluxo podem não ser adequadas para avaliação de genotoxicidade enm especificamente devido à interferência de partículas22.
Um fator limitante dos modelos esferoides que se submetem ativamente à divisão celular é o seu tamanho. A otimização da densidade de semeadura é fundamental, pois é preciso haver células suficientes que permitam que o modelo continue a proliferar; mas não muito alto um número de células, o que resulta no esferoide se tornando excessivamente compacto, levando a um núcleo necrosado aumentado. Acredita-se que a causa dessa necrose seja a restrição de oxigênio e difusão de nutrientes, já que o limite dessa difusão é de aproximadamente 100 – 150 μm de tecido23,24. No entanto, isso depende do tipo celular, número celular, interações de andaimes e condições de cultura25. Desde então, foi demonstrado que aproximadamente 700 μm de diâmetro é o limite para evitar o início prematuro da necrose no centro de esferoides C3A, semeando 4000 células HepG2 por esferoide garante que o diâmetro do modelo no momento da exposição seja ≤500 μm26. Além disso, Shah et al. estabeleceram que as células HepG2 semeadas acima de 5000 células por esferoide apresentaram uma redução de 25% na viabilidade após 7 dias de cultura, o que poderia pertencer ao diâmetro médio de 680 μm e disponibilidade limitada de nutrientes em uma queda de 20 μL de suspensão5. Para superar isso, o modelo concebido no presente protocolo passa por um passo crítico onde a queda de enforcamento é transferida para poços revestidos de agarose após a formação inicial do esferoide. Isso garante um maior volume de cultura média está presente para sustentar o número crescente de células dentro dos esferoides. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 permanece mais de 70% viável após 10 dias de cultura e pode ser utilizado para avaliação de risco de longo prazo in vitro. 
Embora o modelo esferoide HepG2 possa suportar regimes de exposição aguda e de longo prazo, o meio de cultura celular refrescante durante períodos de cultura prolongado é restrito para este modelo, pois a substituição completa do meio não é aconselhada devido à perda potencial dos esferoides. Presume-se que, com as exposições enm, a tendência de dispersões homogêneas de ENM para aglomeração e sedimentos é alta. No entanto, é notável que a taxa em que um sedimento ENM pode variar dependendo dos parâmetros de partículas (por exemplo, tamanho, forma e densidade) e pode ser determinada teoricamente usando o modelo de sedimentação in vitro, difusão e dosimetria (ISDD), ou seus derivados recentes, muitas vezes referidos quando se aproxima da exposição ENM (suspensão) se aproxima27,28. Com isso é mente, supõe-se que se apenas 50% do meio de cultura celular for cuidadosamente removido da superfície da cultura celular, a interrupção e posterior remoção da dose ENM deve, em teoria, ser mínima. No entanto, com a moção browniana em jogo, isso pode não ser estritamente o caso e mais trabalhos na deposição e sedimentação de cada ENM em particular a ser testado devem ser realizados para garantir que a dosimetria correta seja mantida ao longo dos regimes de exposição a longo prazo27. Principalmente, esta é uma limitação potencial a ser considerada ao realizar regimes repetidos de dosagem, pois isso poderia ser fundamental para a concentração final e acumulada. Exposições baseadas em produtos químicos, por outro lado, embora não sem suas próprias limitações a considerar, oferecem uma abordagem mais simplista na forma de que as substâncias químicas tendem a permanecer em solução e, portanto, uma substituição direta da concentração química original, além da concentração recém-adicionada, garante que qualquer produto químico perdido durante o refresco da mídia seja substituído emconformidade com 29. Aplicações futuras incluiriam avaliar a adequação do modelo para regimes de exposição repetida em períodos de cultura de longo prazo, uma vez que estratégias de dosagem repetidas são crucialmente importantes para avaliar a capacidade de um determinado sistema de órgãos de amenizar ou superar os efeitos adversos, se houver, induzidos pela bioaccumulação de substância abiótica.
Em conclusão, este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar uma série de cenários de exposição realista, proporcionando assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar tanto a AVALIAÇÃO DE ENM quanto a avaliação de riscos químicos de forma rotineira e de fácil acesso.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM) em uma infinidade de aplicações de base humana (por exemplo, alimentos, cosméticos, vestuário, equipamentos esportivos, eletrônicos, transporte e medicina), é inevitável que os seres humanos sejam expostos ao ENM regularmente. Com isso, há preocupações crescentes de que o novo, tamanho de características fisio-químicas específicas que considerem esses materiais vantajosos em inúmeras aplicações, possa causar efeitos adversos sobre a saúde humana e o meio ambiente concomitantemente. Atualmente, muitas atividades internacionais estão em vigor para refletir ativamente exposições mais fisiologicamente relevantes a esses ENM e avaliar a toxicidade potencial desses materiais em cenários de exposição aguda, de longo prazo e repetidos de baixa dose.
Toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois é amplamente conhecido que o fígado é um dos principais locais de acumulação de ENM pós exposição1,2. Além disso, o fígado é o sistema de órgãos primários para metabolismo e desintoxicação de substâncias que entram em circulação sistêmica3. Com base no entendimento aceito de que modelos hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades de interações multicelulares intrincadas ou representam adequadamente a atividade metabólica observada in vivo, um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos in vitro 3D robustos e fisiologicamente relevantes para tecnologias substitutas in vivo foi estabelecido4,5. A utilização de tecnologias avançadas de cultura 3D melhora a longevidade de modelos hepáticos in vitro, permitindo que regimes de exposição repetidas e de longo prazo sejam investigados. Além disso, esse formato de cultura avançada promove a formação de características fisiológicas e organotípicas aprimoradas, como bile canaliculi, processos de transporte ativo e capacidades de metabolização de medicamentos CYP450 aprimorados, melhorando assim a previsibilidade dos modelos6. Modelos hepáticos in vitro atuais 3D constituídos por monoculturas (somente hepatócitos) ou co-culturas (hepatócitos com células não equilíquicas) existem em vários formatos, desde microtissues ou esferoides em placas de aderência ultralow, esferoides de gota suspensa, células embutidas em matrizes e/ou andaimes e plataformas de cultura celular microfluida, todos os quais são considerados modelos avançados in vitro eficazes para avaliação de toxicidade hepática6,7. No entanto, a maioria desses sistemas de modelos são de alta manutenção, exigem equipamentos especializados e são caros. Além disso, esses modelos são frequentemente estáticos (ou seja, modelos de células nãondividing) que impedem seu uso na avaliação de pontos finais de perigo, como testes de genotoxicidade utilizando métodos que quantificam danos consertos de DNA. A genotoxicidade é um pré-requisito central na toxicologia regulatória, e é um componente vital da avaliação de risco de qualquer toxicante8. Não há um único ensaio que possa ser aplicado para quantificar todas as formas de dano de DNA que possam surgir após a exposição a um agente exógeno. No entanto, um componente central da bateria de teste de genotoxicidade in vitro é o ensaio de micronucleus, que é uma técnica confiável e multifacetada que mede danos cromossômicos brutos9. É uma técnica padrão-ouro descrita pela Diretriz de Teste da OCDE 487, para avaliação de danos in vitro de DNA e genotoxicidade e faz parte do requisito da bateria de teste para avaliação de risco regulatório10,11.
A linha celular hepatocelular humana, HepG2, é amplamente utilizada para a triagem inicial de avaliação de riscos, pois as células estão prontamente disponíveis, relativamente baratas à fonte, simples à cultura e amenáveis à triagem de alto rendimento12,13. Quando cultivadas em estruturas esféricas 3D, elas têm sido demonstradas para recapitular bem o microambiente hepático e oferecer um modelo hepático com capacidades proliferativas suficientes para suportar o ensaio de micronucleus3. Foi estabelecido mais desenvolvimento dos modelos esferoides HepG2 para melhorar a longevidade e a funcionalidade hepática do modelo, a fim de apoiar a avaliação de risco genotoxicidade em regimes de exposição repetidas a longo prazo (≤14 dias). Assim, em consonância com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, o presente protocolo foi estabelecido para fornecer um modelo hepático in vitro avançado 3D capaz de avaliar de forma confiável múltiplos pontos finais toxicológicos (por exemplo, funcionalidade hepática, (pro-)marcadores inflamatórios, citotoxicidade e genotoxicidade) seguindo exposições químicas agudas, de longo prazo e repetidas e ENM em uma rotina e de forma facilmente acessível.
Aqui, apresentamos um método para estabelecer uma linha de células hepatócitos 3D fisiologicamente relevante baseada em sistema de modelo in vitro para avaliação de risco de genotoxicidade após exposições agudas ou de longo prazo do ENM. O protocolo pode ser dividido em 6 estágios-chave: acultura de células HepG2 criopreservadas; Preparação de sferóide hepG2; Transferência de spheróide hepG2 de queda de suspensão para suspensão de agarose; Colheita de sferóides hepG2; ensaio micronucleus e pontuação; e análise de dados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM), a exposição ao ENM é inevitável e o desenvolvimento de sistemas de teste in vitro robustos e preditivos é essencial. A toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois o fígado serve a um papel vital na homeostase metabólica e na desintoxicação, além de ser um dos principais locais de acumulação de ENM após a exposição. Com base nisso e no entendimento aceito de que os modelos de hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades das interações multicelulares intrincadas e da atividade metabólica observada in vivo, há um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos 3D fisiologicamente relevantes sob medida para fins de avaliação de riscos ENM in vitro. De acordo com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, foi desenvolvido um modelo hepático baseado em células 3D HepG2, que é um sistema fácil de usar e econômico que pode suportar regimes de exposição enm estendidos e repetidos (≤14 dias). Esses modelos esferoides (≥500 μm de diâmetro) mantêm sua capacidade proliferativa (ou seja, modelos celulares divisórias) permitindo que eles sejam acoplado ao ensaio de micronucleo 'padrão ouro' para avaliar efetivamente a genotoxicidade in vitro. Sua capacidade de relatar uma gama de pontos finais toxicológicos (por exemplo, função hepática, (pro-)resposta inflamatória, citotoxicidade e genotoxicidade) tem sido caracterizada usando vários ENMs em regimes de exposição agudos (24 h) e de longo prazo (120 h). Este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar exposições enm mais realistas, fornecendo assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar a avaliação de riscos ENM de forma rotineira e de fácil acesso.

A adequação deste modelo spheróide hepático 3D baseado em linha celular para cultura de longo prazo e avaliação de risco genotipico foi avaliada pela realização da caracterização da linha de base para determinar a viabilidade e funcionalidade hepática do modelo ao longo da duração de 14 dias na cultura, bem como sua aplicabilidade para o ensaio do micronucleus.
Caracterização da linha de base do modelo spheroid hepg2 hepg2 3D Antes de qualquer avaliação toxicológica in vitro, é importante verificar se os esferoides HepG2 3D formaram-se adequadamente antes de realizar a transferência de agarose ou tratamento químico/ENM. Os spheróides hepG2 produzidos usando o método de queda de suspensão geralmente levam de 2 a 3 dias após a semeadura (4000 células/esferoides) para formar esferoides compactos e esféricos com diâmetro médio de 495,52 μm W x 482,69 μm H, como mostrado na Figura 5A-5C. Os spheróides hepG2 que se formaram corretamente e são aceitáveis para serem usados para avaliação toxicológica in vitro devem ter uma estrutura compacta e esférica com uma superfície lisa e sem projeções visuais. A Figura 5 fornece exemplos de boa qualidade(Figura 5D-F) e um esferoides de má qualidade(Figura 5G-I). Este último deve ser descartado. Normalmente, 90-95% dos esferoides formados por placa se formarão corretamente e serão viáveis para novas experimentações.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figura 5: Imagens de microscopia leve que exibem a morfologia natural dos esferoidesHepG2 formadas através do método de queda de suspensão . (A-C) mostrar dia 2 e(D-I) Dia 4 HepG2 hefóides pós semeadura. (D-F) são exemplos de spheroids HepG2 de boa qualidade, enquanto(G-I) mostra esferoides mal formados. Todas as imagens foram tiradas em um objetivo X20 usando um microscópio. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para confirmar ainda mais a viabilidade esferoide HepG2, um ensaio colorido básico do Bromocresol Green Albumin (BCG) ou Urea Assay pode ser realizado para avaliar sua funcionalidade semelhante ao fígado. A funcionalidade semelhante ao fígado foi avaliada de acordo com a viabilidade usando o Ensaio de Exclusão Azul trypan durante um período de cultura de 14 dias para determinar a longevidade do modelo esferoide hepático e estabelecer se poderia suportar a avaliação de risco baseada em ENM/química a longo prazo(Figura 6). A concentração de albumina permaneceu consistente durante o período cultural. A produção de ureia apresenta um aumento na concentração de ureia produzida por esferoide ao longo de uma semana na cultura antes de atingir um patamar no dia 7. É importante notar que os níveis de albumina e ureia produzidos nos esferoides HepG2 3D são substancialmente maiores do que os observados na mesma linha celular cultivada em formato 2D. De fato, as culturas 2D das células HepG2, os níveis de pico de albumina e ureia foram de 0,001 mg/mL e 0,010 ng/μL, respectivamente. Além disso, em trabalhos anteriores publicados por Shah et al. utilizando um sistema esferoide HepG2 quase idêntico, os autores destacam uma notável melhora na atividade metabólica (CYP1A1 e CYP1A2) nos sistemas de modelos in vitro 3D HepG2 quando comparados com as células HepG2 cultivadas em 2D5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figura 6: Dados de caracterização da linha de base de 14 dias para esferoides hepG2 de fígado. Após a transferência da queda de suspensão, (A) destaca a viabilidade do modelo esferoide HepG2 durante um período de 14 dias, enquanto(B) e (C) destacam a funcionalidade de albumina e ureia semelhante ao fígado, respectivamente. Dados médios ± SEM apresentados, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Com o desenvolvimento inevitável de um núcleo necrosado, uma limitação conhecida das culturas esferoides hepáticos 3D, a viabilidade deste modelo baseado em HepG2 teve que ser estabelecida para demonstrar que era capaz de sustentar regimes de exposição a longo prazo (5-10 dias) mantendo a capacidade proliferativa necessária para suportar o ensaio micronucleus5. De fato, este modelo de spheroid hepático 3D tem sido mostrado para manter >70% de viabilidade ao longo de 10 dias na cultura. Com base nisso e em conjunto com a funcionalidade sustentada do fígado observada ao longo do período de cultura de ≥ 14 dias, este modelo de spheroid hepático 3D pode, assim, suportar regimes de exposição enm a longo prazo e repetidos até 10 dias de duração (ou seja, antes que a viabilidade dos esferoides caia abaixo de 70%). Para referência, é aconselhável que os níveis de albumina para spheróides HepG2 semeados em 4000 células/esferoides devem ser ≥20,0 ng/μL enquanto a produção de ureia deve ser ≥0,25 ng/μL antes de realizar uma avaliação toxicológica in vitro com este modelo.
Avaliação genotoxicidade de nanomateriais projetados Para avaliação da genotoxicidade, o ensaio micronucleus foi utilizado para determinar a presença de micronuclei após exposições enm agudas (24 h) e de longo prazo (120 h). Aflatoxina B1 é um conhecido carcinógeno hepático16,17 e é um controle positivo recomendado para o ensaio de micronucleus. Experimentos de otimização mostraram que 0,1 μM de AlfatoxinA B1 induz uma resposta genotoxica positiva (≥2,0 vezes) em esferoides hepáticos hepg2 3D e, portanto, é usada em todos os ensaios micronucleus realizados com este modelo. Para garantir a validade dos resultados do ensaio de micronuclear usando o modelo spheroid HepG2, a frequência de micronucleus de fundo para células HepG2 utilizadas neste modelo in vitro 3D deve estar dentro de uma faixa de 0,6% a 1,2%. Como resultado, a AlfatoxinA B1 deve induzir uma resposta genotoxica de pelo menos duas vezes maior do que a observada com o controle negativo; assim, 0,1 μM de Alfatoxina B1 deve induzir uma frequência micronuclei entre 1,5% e 3,0%. Usando esses parâmetros de controle, a genotoxicidade associada da ENM in vitro pode então ser avaliada de forma confiável. Com base na Diretriz de Teste da OCDE 487, é importante notar que, ao testar um ENM ou químico, as concentrações selecionadas não devem induzir mais de 55% ± citotoxicidade de 5% (indicada por uma redução dos valores de CPBI ou RVCC em relação ao controle negativo)11. A Figura 7 ilustra os dados gerados quando a AflatoxinA B1 e dois ENMs (dióxido de titânio (TiO2) e lasco (Ag)) foram avaliados após exposições agudas e de longo prazo nos esferoides HepG2, e o potencial genotóxico subsequente foi analisado usando o ensaio micronucleus. Ambos os ENMs avaliados foram testados em um regime noncytotóxico, de baixa dose de 5,00 μg/mL sobre uma exposição aguda (24 h) e regime de exposição a longo prazo (120 h). Uma tendência semelhante para genotoxicidade em ambos os ENMs TiO2 e Ag podem ser observadas, pela qual a resposta elevada de genotoxicidade que resultou após a exposição de 24 horas não ficou evidente após uma exposição de longo prazo de 5 dias. Isso foi apesar da genotoxicidade sustentada induzida pelo controle positivo da Aflatoxin B1 em ambos os pontos de tempo.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figura 7: Avaliação genotoxicidade após a exposiçãotio 2 e ag ENM em spheroids hepG2. Avaliação genotoxicidade (frequência de micronucleus) utilizando o posto de ensaio micronucleus(A) aguda (24 horas) e(B)exposição a longo prazo (120 horas) a 5,00 μg/mL de TiO2 e Ag ENM. O controle negativo é apenas uma mídia, enquanto o controle positivo é de 0,1 μM de Aflatoxin B1. Os dados médios (n=2) apresentaram ± SD. Significância indicada em relação ao controle negativo: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

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In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

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Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

O Chip Multi-organ - Uma plataforma microfluídica para longo prazo Coculture Multi-tecidos

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

In Vitro 3D Cell-Cultured Modelos arteriais para estudar a segmentação de drogas vasculares sob fluxo

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...