Este procedimento para fundir e inserir janelas de silicone reduz as barreiras técnicas à imagem intravital longitudinal. Nosso protocolo produz janelas resistentes e facilmente adaptáveis que são bem toleradas pelos animais. Usando essa técnica, temos câncer de imagem e células imunes no fígado, pâncreas e glândula mamária.
Com ajustes mínimos, poderia ser adaptado a muitos locais anatômicos e questões biológicas. Para quem está experimentando essa técnica pela primeira vez, pratique a liberação de pequenas quantidades de cola da seringa. Aplicar muita cola irá nublar o campo de imagem e dificultar o trabalho da área cirúrgica.
Comece a fundar a janela de silicone depositando uma pequena quantidade do polímero de silicone recém-preparado, polidimtilsiloxano, de PDMS, em uma superfície lisa limpa, e ajuste a razão volume/área para obter a espessura desejada. Uma vez que o PDMS é depositado na superfície de fundição desejada, pressione levemente uma grade de aço inoxidável no silicone para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais. Para remover as bolhas de ar e desgas o polímero de silicone, coloque a superfície revestida em um desiccador de vácuo por 45 minutos.
Quando feito, cure o polímero em um forno a 75 a 80 graus Celsius por 45 minutos. Marque o polímero nas bordas do molde e use fórceps para descascar suavemente as janelas curadas da superfície usada para fundição. Coloque o mouse na posição de decúbito lateral esquerdo.
Prepare o camundongo anestesiado para cirurgia aplicando 10% de volume por solução de iodo povidone em volume e 70% de volume por volume de etanol três vezes consecutivamente no local cirúrgico raspado. Deve-se tomar cuidado para manter um campo cirúrgico estéril. Em seguida, use tesouras estéreis e fórceps para fazer uma incisão de 10 milímetros no flanco direito a três milímetros abaixo do arco costal.
Remova uma seção de um centímetro quadrado da pele e use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele. Deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico em uma placa de poço estéril e retire-a com uma seringa de calibre 31 para aplicar na superfície do fígado ao redor das bordas da área a ser imageada, em seguida, posicione a janela na área desejada, e segure-a firmemente contra o fígado por aproximadamente dois minutos até que o adesivo tenha secado. Depois de dobrar as bordas da janela sob o peritônio depositar uma pequena quantidade do adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio, empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.
Da mesma forma, sele o peritônio depositando uma pequena quantidade do adesivo cirúrgico antes de empurrar para baixo da pele, em seguida, aplique cola ao redor das bordas da janela para criar uma borda que impedirá que a pele cresça de volta sobre a janela. Para inserir a janela no pâncreas, coloque o mouse na posição de decúbito lateral direito e faça a incisão no flanco esquerdo antes de remover uma seção do peritônio como demonstrado anteriormente. Usando cotonetes de algodão estéreis encharcados com soro fisiológico estéril, puxou suavemente o baço para visualizar o pâncreas.
Reposicione o pâncreas com os cotonetes umedecidos para tornar mais área de superfície visível através da incisão. Uma vez que o pâncreas seja acessado, insira e sele a janela de imagem na área desejada, conforme explicado anteriormente. Para acessar a glândula mamária, coloque o rato na posição supina e faça uma incisão de 10 milímetros medial para um dos mamilos inguinais usando tesouras estéreis e fórceps.
Remova uma seção de 0,5 centímetro quadrado da pele acima da glândula mamária e, em seguida, separe suavemente a glândula mamária da pele, espalhando a tesoura estéril entre as duas superfícies para interromper a adesão. Use uma seringa de calibre 31 para aplicar uma pequena quantidade do adesivo cirúrgico na superfície da glândula mamária ao redor das bordas da área a ser imageda. Posicione e segure a janela firmemente contra a glândula mamária até que o adesivo se adoecie.
Depois de dobrar as bordas da janela sob a pele, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob a pele, e empurre para baixo na pele com fórceps para fixar a pele à janela. Aplique a cola ao redor das bordas da janela para criar uma borda que impedirá que a pele cresça de volta sobre a janela. Antes de iniciar a sessão de imagem, limpe a janela de qualquer detrito residual limpando-a suavemente com um cotonete mergulhado em 70% de etanol.
Ao utilizar uma lente de imersão de água, aplique o gel de ultrassom na janela evitando bolhas. Para iniciar a imagem, localize e coloque a grade em foco através dos oculares. Em seguida, determine a profundidade aproximada da imagem do tecido, definindo a parte inferior da grade para zero.
As informações ajudarão na localização do plano Z correspondente em sessões de imagem subsequentes. Para identificar o mesmo local em várias sessões de imagem, utilize os quadrados na grade como ponto de referência. Durante a sessão de imagem, observe a orientação da grade e a localização de cada campo de visão visualizado dentro da grade.
A grade pode ser usada para navegar de volta para áreas específicas de grade e campos de imagem no sucesso de sessões de imagem. Após cada sessão de imagem remova qualquer meio de imersão de lente residual e detritos limpando suavemente a janela com um cotonete mergulhado em 70% de etanol. A janela de silicone permite capturar a dinâmica infiltração de células imunes ao longo do tempo.
A análise representativa ilustra a infiltração de neutrófilos dentro do tecido da glândula mamária remodelante nos dias dois e quatro. A janela de silicone permite que os tumores sejam visualizados em vários pontos de tempo ao longo de semanas após a inserção da janela. As janelas fundidas com 200 miligramas de PDMS são geralmente melhores para implantação cirúrgica, pois apresentaram resistência significativamente maior do que as janelas fundidas com 150 miligramas.
Note-se que as janelas PDMS não eram tão rígidas quanto o vidro padrão, representado pelo módulo young das janelas de vidro sendo significativamente maior que o PDMS. A inserção da janela em diferentes órgãos foi bem tolerada, pois a maioria dos ratos continuou a ganhar peso ao longo do tempo. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é selar totalmente a janela usando cola.
Isso evita que a infecção, o tecido sequem e o deslocamento da janela. Após o procedimento, as injeções ortotópicas podem ser feitas através da janela de silicone, permitindo que os pesquisadores estudem uma grande variedade de tópicos, como proliferação celular, interações célula-células e eficácia terapêutica.
