Este protocolo permite quantificar os níveis e a dinâmica da metilação da arginina. Essa modificação desempenha importantes papéis regulatórios e pode servir como um biomarcador para a doença. A vantagem deste método é que ele fornece um fluxo de trabalho simples para um número quase ilimitado de matrizes que vão desde células, meios até tecidos e biofluidos.
A metilação da arginina é elevada em muitos tipos de câncer humanos e os primeiros inibidores das transferases do método da arginina são testados em ensaios clínicos. Esse método poderia ajudar na estratificação dos pacientes e na avaliação de riscos. Demonstrando o procedimento estará Hansjorg Habisch, um técnico de pesquisa do meu laboratório.
Para amostras líquidas, adicione 400 microlitros de metanol gelado a 200 microlitros da amostra, seguido de incubação por 30 minutos a menos 20 graus Celsius. Centrifugar esta amostra a 10.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Mova o sobrenadante e recolha o pellet em tubos de 1,5 mililitros.
Para materiais sólidos, adicione 600 microlitros de água a 66% de metanol em tubos de polpação contendo 30 a 60 miligramas de tecido ou pellets celulares. Homogeneizar o tecido mole uma vez por 20 segundos e o tecido rígido duas vezes por 20 segundos com um intervalo de cinco minutos entre eles. Coloque imediatamente a amostra no gelo e transfira todo o lisado para um novo tubo de 1,5 mililitro, seguido de incubação.
Em seguida, centrifugar a amostra a 10.000 G por 30 minutos. A quatro graus Celsius, selecione o sobrenadante em tubos de 1,5 mililitros e prossiga com a hidrólise de proteínas usando este sobrenadante. Truncar as tampas de cada tubo.
Em seguida, adicione 500 microlitros de nove molares de ácido clorídrico a cada amostra. Finalmente, coloque os tubos em tubos de vidro. Feche-os com tampas firmemente, garantindo a vedação adequada, e coloque esses tubos em um copo de vidro parcialmente cheio de areia.
Hidrolisar as amostras por 16 horas a 110 graus Celsius em uma câmara de secagem. Resfrie as amostras e liofilize-as durante a noite usando uma centrífuga de alto vácuo. No dia seguinte, dissolver os pellets completamente secos em um mililitro de ácido clorídrico 0,1 molar.
Adicione 50 microlitros de clorofórmio a cada tubo e dissolva completamente o pellet usando uma pipeta de 1.000 microlitros. Transfira o volume completo para um novo tubo e centrifugar as amostras por 10 minutos. Recolha cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico num novo tubo.
Use tubos de plástico para tubos manuais ou de vidro para extração robótica em fase sólida. Para a extração manual em fase sólida, pré-condicione os cartuchos em cada execução, seguido de uma centrifugação de um minuto. Depois disso, carregue a amostra em cartuchos SPE e centrifuja-os a 600 G por dois minutos à temperatura ambiente.
Lave os cartuchos com um mililitro de água três vezes, cada lavagem seguida de centrifugação por um minuto. Em seguida, lave cinco vezes com um mililitro de ácido clorídrico 0,1 molar, seguido de centrifugação por um minuto a 800 G à temperatura ambiente. Lave os cartuchos duas vezes com um mililitro de metanol seguido de centrifugação por um minuto.
Elute arginina e seus derivados em um único tubo de 15 mililitros, adicionando um mililitro de três soluções de substituição X e centrifugando duas vezes por um minuto. Para a extração robótica em fase sólida, coloque os tubos para coleta de eluídos e os tubos de vidro contendo a fase superior do líquido bifásico na respectiva posição do robô. Use um aplicativo ou método no software com base nas etapas descritas para o SPE manual.
Liofilizar as amostras durante a noite para secar completamente para se livrar de amônia e água. Dissolva cada amostra em 500 microlitros de tampão RMN até que se torne homogênea. Em seguida, transfira uma quantidade igual de amostra homogênea para cada tubo de RMN.
Os espectros J-RES de hidrolisados de proteínas de levedura purificados usando o protocolo SPE são mostrados aqui. Diferentes mudanças químicas características podem discriminar L-arginina e ADMA em 3,25 e 3,02 partes por milhão. Ambas as substâncias podem ser separadas e quantificadas em uma matriz celular.
Com base no número de prótons do grupo metilo ou metileno específico no respectivo deslocamento químico, uma espectroscopia de ressonância magnética nuclear H permite uma quantificação precisa. Usando essa abordagem, os deslocamentos químicos de ressonância magnética nuclear de um H de SDMA e MMA podem ser separados e quantificados por deslocamentos químicos característicos em 2,76 partes por milhão de SDMA e 2,74 partes por milhão de MMA. Ao executar este protocolo, colete cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico contendo a fração solúvel em água com uma pipeta e transfira-a para novos tubos.
Use tubos de 1,5 mililitros para SPE manual ou vidro de classe para SPE robótico. Evite derramar clorofórmio e seu conteúdo. Os eluídos contendo arginina e as espécies de arginina metilada são analisados por espectroscopia de RMN.
Isso produz quantidades absolutas dessas espécies. Nossa tecnologia é atualmente usada em uma infinidade de projetos de pesquisa básica com o objetivo de dissecar o papel fisiopatológico da metilação da arginina. Além disso, estamos avaliando a metilação da proteína arginina como um candidato a biomarcador em várias doenças humanas.
