Nosso protocolo é significativo porque permite aos pesquisadores que trabalham em fungos não-modelo a oportunidade de estabelecer tecnologias de edição de genoma de ponta em seus laboratórios. Como não se baseia em técnicas existentes, como sistemas de expressão, esse protocolo tem a vantagem de ser mais fácil de estabelecer em sistemas não modelo. Este método pode ser usado em diferentes espécies de fungos e pode ser usado para elucidar funções de genes envolvidos no acasalamento, crescimento e patogenicidade da via.
Portanto, ao realizar este procedimento, deve-se ter dias consecutivos suficientes para competir com o protocolo, pois há apenas alguns pontos no experimento em que ele pode ser pausado. Para colher a conidia, filtre a cultura líquida através de uma camada de pano de laboratório estéril em tubos de centrífuga de 50 mililitros para centrifugação. Resuspend a pelota conidia em cinco mililitros de água e ver uma alíquota de 10 microliter da solução conidia sob um microscópio leve em uma ampliação de 40X para confirmar que apenas conidia foram recuperadas.
Em seguida, adicione 200 mililitros de caldo fresco de 1% de extrato de malte a um frasco de 500 mililitros e transfira todo o volume de conidia para o frasco. Em seguida, incubar a cultura líquida por até 12 horas em uma incubadora de agitação de 25 graus Celsius a 120 revoluções por minuto. Para colher os germes, transfira a cultura para tubos de centrífugas de 50 mililitros para centrifugação e resuspense os germlings em até 10 mililitros de um sorbitol molar.
Adicione um mililitro de solução germinante a várias concentrações de solução enzimática e incubar a solução de enzimas de esporos por duas a três horas na incubadora de agitação a 80 revoluções por minuto. Para colher os protoplastos, filtrar a solução enzimática através de uma camada de pano de laboratório estéril e coletar os protoplastos por centrifugação. Em seguida, resuspenque cuidadosamente a pelota de protoplasto em 200 microlitros de tampão STC e verifique uma alíquota de 10 microliter da solução sob um microscópio para confirmar que apenas protoplastos foram recuperados.
Para começar a transformação, combine aproximadamente cinco vezes 10 aos seis protoplastos com um único volume de solução de ribonucleoproteína e aproximadamente seis microgramas do fragmento de DNA do doador. Em seguida, use uma pipeta para escorrizar lentamente e uniformemente um mililitro de solução recém-preparada de 30% PTC na suspensão do protoplasto para criar uma camada hidrofóbica sobre os protoplastos e incubar a solução por 20 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione cinco mililitros de meio de controle osmótico à suspensão do protoplasto, tubulando lentamente e suavemente para misturar completamente a solução.
Após a mistura, incubar a solução de protoplasto na incubadora de agitação a 80 revoluções por minuto durante a noite. Na manhã seguinte, divida a solução entre cinco placas de cultura de 60 milímetros. Adicione 10 mililitros de ágar médio de controle osmótico suplementado com 30 microgramas por mililitro de Higromicina B a cada placa e gire lentamente cada placa para misturar.
Deixe a primeira camada de ágar definir antes de adicionar 10 mililitros de ágar médio de controle osmótico suplementado com 40 microgramas por mililitro de Hygromiccin B dois cada placa. Depois de permitir que a segunda camada de ágar se estalasse, incubar as culturas a 25 graus Celsius até que isolados únicos possam ser observados crescendo através de ambas as camadas de ágar. Para recuperar os isolados transformados com sucesso, transfira os isolados individuais capazes de crescimento para placas de ágar de extrato de malte fresco suplementadas com 50 microgramas por mililitro de Hygromycin B.To avaliar os efeitos da ruptura genética direcionada nas capacidades heterotóllicas do fungo, co-inoculado extrato de malte fresco meio com uma cepa mutante, bem como uma tensão do tipo de acasal de matismo oposto.
Ao trabalhar com H.omanensis, cubra, mas não sele as placas. Coloque as placas em temperatura ambiente por sete dias. Ao final da incubação, avalie visualmente a produção de estruturas sexuais.
Para testar as capacidades homotálicas da cepa mutante, inocular o extrato de malte fresco extrai meio de ágar com a variedade mutante de interesse e incubar a placa em temperatura ambiente por uma semana, como demonstrado. Para avaliar os efeitos da interrupção na taxa de crescimento do fungo que está sendo estudado, insira a parte traseira de uma grande ponta de pipeta estéril nas bordas ativamente crescentes da cultura de cada mutante e tipo selvagem de interesse para criar plugues de ágar cobertos de múlais e inoculado meio extrato de malte fresco. Pelo menos três réplicas devem ser feitas por tipo de cultura.
Após três dias de crescimento a 20 graus Celsius, meça o crescimento de cada placa em dois diâmetros perpendiculares. Conidia usada como material inicial para o protocolo é permitida a germinar e crescer até que se tornem germins jovens. Note que fios mycelial maduros como estes são muito maduros para degradação e não devem ser usados.
Quando as células não têm mais paredes celulares, elas se tornam muito sensíveis à disrupção mecânica e liberam protoplastos redondos que podem ser colhidos para transformação. O sucesso do protocolo pode ser confirmado após uma análise fenotípica das cepas mutantes. Para este isolado mutante MAT 127, a taxa de crescimento radial vegetativo foi significativamente reduzida, sugerindo um efeito pleiotrópico para o novo gene de acasalamento.
Além disso, o isolado mutante era incapaz de completar um ciclo sexual produzindo apenas estruturas sexuais imaturas que não produziam esporos sexuais em comparação com o isolado do tipo selvagem que completou todo o ciclo sexual dentro de poucos dias de incubação. O RNA é muito sensível e se degrada muito facilmente. Portanto, um ambiente de trabalho limpo e trabalhar rapidamente no gelo são essenciais para o sucesso deste experimento.
Uma vez que o isolado mutante tenha sido gerado com sucesso, eles podem ser submetidos à análise fenotípica ou RNA-seq conforme apropriado para o gene que está sendo caracterizado.
