Gostamos de reconhecer os Institutos Nacionais de Saúde e o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC para financiamento (R01NS079691).

Os experimentos foram realizados de acordo com o IUCAC na Duke University e na University of California Los Angeles. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57Bl/6J masculinos de 8 a 12 semanas. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água. Os protocolos de analgesia e sedação são descritos como aprovados pelo IUCAC, mas podem diferir dos protocolos utilizados em outros laboratórios.
Os animais podem ser prematuramente eutanizados se experimentarem inquietação excessiva, vocalização (indicando dor incontrolável), autotraímento, mobilidade reduzida ou prejudicada, sinais físicos de infecção dérmica, perda de apetite e/ou perda de peso superior a 10%-15% como resultado da cirurgia de sobrevivência. Não há efeitos adversos antecipados da injeção do gel, pois é composto por um polímero que ocorre naturalmente dentro do cérebro. Os animais devem ser monitorados diariamente, incluindo fins de semana e feriados, e ressarcidos a cada dois dias. Estudos do nosso laboratório e de outros não encontraram déficits no preparo, perda de peso corporal ou sinais/sintomas de abstinência ou estresse crônico em camundongos após esses pequenos derrames corticais ou subcorticais. Se os animais apresentarem algum sinal de infecção local na cabeça, eles devem ser eutanizados. Os animais também devem ser monitorados por mau preparo, condição de ferimentos e evidências de luta entre animais (feridas nas costas). Se houver evidências de luta ou desamscência de feridas, os animais devem primeiro ser tratados após o contato com os veterinários. Isso muitas vezes envolve antibiótico na água e/ou aplicação de antibióticos tópicos locais. Se essas medidas não produzirem cura, os animais devem ser eutanatizados.
1. Preparação de materiais e instrumentos
<ol><li>Prepare o corante fototrombótico antes da cirurgia. Pese 15 mg de Rose Bengala em um tubo de microcentrifus de 2 mL. ATENÇÃO: Rose Bengala pode causar sérios danos oculares/irritação.<ol>
<li>Dissolva a Bengala Rosa em 1,5 mL de PBS filtrado estéril para fazer uma concentração de trabalho de 10 mg/mL.</li>
		<li>Vórtice do tubo até que nenhum aglomerado seja visível, indicando que o corante se dissolveu completamente, depois cubra em papel alumínio até que use mais. NOTA: A quantidade de corante necessária dependerá do número de ratos. O corante é injetado intraperitoneally IP a uma concentração de 10 μL/g, por exemplo, 200 μL para um mouse de 20 g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do rato durante a anestesia (37 °C).</li>
	<li>Prepare tesouras autoclavadas, fórceps, algodão, pomada ocular veterinária, cola cirúrgica ou material de sutura, um marcador cirúrgico azul ou preto, e álcool estéril e lenços de iodo beta. Prepare a broca óssea com cabeças de broca esterilizadas.</li>
	<li>Ligue a esterilização das contas a 160 °C para permitir a esterilização de instrumentos entre a cirurgia dos camundongos. Reserve um tubo cônico de 50 mL de solução salina estéril ou 1x PBS para posterior utilização na manutenção de uma área de operação hidratada.</li>
	<li>Conecte o laser ao dispositivo estereotaxico. Usando óculos de segurança a laser, meça o poder do laser (mW). ATENÇÃO: Use óculos de segurança a laser sempre que o laser estiver ligado no procedimento.<ol>
<li>Ajuste a corrente no console a laser, seguindo as instruções de fabricação a laser, até que a saída de energia a laser leia 10 mW, e defina a corrente como um pré-definido no console de tela inicial. Em seguida, ajuste a corrente novamente para estabelecer outro pré-definido onde a potência de saída do laser lê 40 mW. Agora desligue o laser até que use mais. NOTA: Os 10 mW serão usados para orientar o laser antes de ser utilizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma gaiola limpa para ratos após a cirurgia. Em seguida, coloque o rato na câmara de indução com uma concentração isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo pare e sua respiração chegue a uma taxa lenta e constante.</li>
	<li>Uma vez dormindo, pese o rato para determinar quanto corante Rose Bengala injetar. Em seguida, transfira e fixe o mouse para o dispositivo estereotaxico com uma concentração de isoflurane de manutenção de 1,5%. NOTA: O aumento das concentrações de isoflurane pode dilatar os vasos e evitar oclusão suficiente ou derrames consistentemente dimensionados entre camundongos.</li>
	<li>Aplique pomada ocular veterinária em ambos os olhos. NOTA: Observe a respiração e a temperatura durante todo o procedimento e belisque os dedo dos dedo ocasionalmente para garantir que o mouse não possa sentir nada.</li>
</ol>2. Traço fototrombótico modelo9
<ol><li>Raspe a pele da cabeça do rato e prepare asepticamente a área usando um lenço de álcool seguido de uma limpeza beta de iodo. Repita três vezes. NOTA: Se necessário, use um lenço de álcool extra no final para limpar todo o iodo beta, pois causa irritação na pele que leva os ratos a coçar o crânio após a cirurgia.</li>
	<li>Usando uma tesoura de pequeno funcionamento, faça uma incisão lateral entre as orelhas até os olhos, cerca de 1-2 cm. Faça isso puxando a pele para cima com fórceps para criar uma tenda, cortando uma vez para baixo, em seguida, inserindo a tesoura na abertura e criando uma incisão contínua da linha média.</li>
	<li>Separe a pele e pressione levemente os ossos parietal com os fórceps para localizar o bregma. Marque o bregma com um ponto usando o marcador cirúrgico. NOTA: O movimento do fragmento ósseo destaca a borda frontal dos ossos parietais. O bregma é o ponto central em que os fragmentos ósseos frontal e pariário se encontram(Figura 1A).</li>
	<li>Usando óculos de segurança laser, mova o laser sobre o crânio do mouse, fixando o dispositivo estereotaxico em um ângulo de 90°. Selecione o pré-configurado de 10 mW e ligue o laser.<ol>
<li>Ajuste o eixo x e y do laser até que ele esteja diretamente sobre o bregma. Reinicie o x e o y no console de exibição digital e, em seguida, mova o laser 1,8 mm à esquerda do bregma. Agora traga o laser o mais perto possível do crânio sem deixá-lo tocar o crânio.</li>
		<li>Mova o laser para 2,2 mm à esquerda da bregma para garantir que ele possa se mover sem quaisquer obstruções. Desligue o laser.</li>
	</ol></li>
	<li>Injete a quantidade apropriada de corante rose bengala intraperitoneally (IP) usando uma agulha descartável de 29 G. Inicie imediatamente um temporizador de 7 minutos para permitir que o corante circule sistemicamente. Selecione o pré-definido por 40 mW sem ligar o laser. NOTA: Uma vez confortável com o procedimento, o corante pode ser injetado antes da preparação asséptica do mouse e terminado antes que os 7 minutos acabem para economizar tempo.</li>
	<li>Ligue o laser (40 mW) quando o temporizador de 7 minutos explodir, enquanto usa óculos de segurança a laser, e defina um temporizador de 10 minutos.<ol>
<li>Depois de 10 min, mova o laser para 2,2 mm à esquerda da bregma sem desligá-lo, e afina mais 10 minutos de temporizador.</li>
		<li>Uma vez que o segundo temporizador de 10 minutos tenha desligado, mude o laser de volta para 10 mW e mova o laser para 2,0 mm à esquerda do bregma. Marque este lugar com o marcador cirúrgico. Em seguida, desligue o laser.</li>
		<li>Levante o laser e desbloqueie-o do ângulo de 90° para que ele possa ser removido do mouse. Neste ponto, aplique o soro fisiológico estéril ou PBS com algodão se a área cirúrgica estiver seca.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfurar em pequenas rajadas na marca de 2,0 mm perpendicular à superfície do crânio. NOTA: Tenha cuidado para perfurar lentamente para evitar perfurar muito profundamente e atingir o cérebro. Haverá uma leve queda/mudança na resistência uma vez que a broca tenha atravessado o crânio, e a perfuração pode causar sangramento.<ol>
<li>Use algodão para absorver qualquer excesso de sangue. É típico ver algum sangue de artérias cortadas no crânio após a perfuração – sangue excessivo significa que a broca atingiu o cérebro. Se isso acontecer, grave o identificador do mouse e siga em frente.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque uma pequena limpeza ao lado do mouse. Usando os fórceps, puxe a pele para perto para se preparar para a colagem. NOTA: A sutura pode ser feita aqui em vez disso. A sutura normalmente requer apenas 3 suturas.<ol>
<li>Usando os fórceps, pegue os dois lados da pele e puxe-os juntos e para cima. Desarme-se em gotas grandes de cola cirúrgica na extremidade da ponta na limpeza antes de aplicar no mouse.</li>
		<li>Aplique a cola cirúrgica com moderação e segure a pele junto com fórceps por 10 s. Continue até que não haja aberturas visíveis. NOTA: A cola sai rapidamente – não aperte a garrafa. Evite colar a pele no crânio ou colocar cola no olho.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois de colar, ou suturar, coloque o rato na nova gaiola para se recuperar da anestesia. Leva de 5 a 10 minutos para o animal se recuperar, e ajuda a descansar metade da gaiola em uma almofada de aquecimento.</li>
</ol>3. Operação de traçado falso
<ol><li>Realize todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima na seção 2, exceto injetar 1x PBS ou soro fisiológico em vez de corante rose bengala.</li>
</ol>4. Injeção de hidrogel ou outros biomateriais
<ol><li>Realize a injeção de biomateriais em um momento definido pelo usuário. Neste experimento foram realizadas injeções entre 5 e 7 dias após o derrame. 2 - 6 μL de hidrogel são injetados (definido pelo usuário).<ol>
<li>Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do rato durante a anestesia (37 °C).</li>
		<li>Prepare tesouras autoclavadas, fórceps, algodão, pomada ocular veterinária, cola cirúrgica ou material de sutura, e álcool estéril e lenços beta iodo. Prepare a broca óssea com cabeças de broca estéreis e as seringas Hamilton de vidro de 25 μL com agulhas metálicas de 30 G.</li>
		<li>Ligue a esterilização das contas a 160 °C para permitir a esterilização de instrumentos entre camundongos.</li>
		<li>Conecte as bombas de injeção ao dispositivo estereotaxico. Defina a vazão para 1 μL/min e ajuste o volume para 4 μL.</li>
		<li>Prepare uma gaiola limpa para os ratos depois da cirurgia.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o rato na câmara de indução com uma concentração isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo pare e sua respiração chegue a uma taxa lenta e constante.<ol>
<li>Uma vez dormindo, transfira e fixe o mouse para o dispositivo estereotaxico com uma concentração de isoflurane de manutenção de 1,5%.</li>
		<li>Aplique a pomada ocular veterinária em ambos os olhos.</li>
		<li>Raspe qualquer pele que possa ter recreado da cabeça do rato, e prepare aseticamente a área usando um lenço de álcool seguido de uma limpeza beta de iodo. Repita três vezes. NOTA: Se necessário, use um lenço de álcool extra no final para limpar todo o iodo beta, pois causa irritação na pele e leva os ratos a coçar o crânio após a cirurgia.</li>
	</ol></li>
	<li>Usando a tesoura pequena e/ou fórceps, reabra a pele acima do cérebro. Use algodão com soro fisiológico estéril ou PBS para limpar quaisquer detritos do crânio. Um círculo branco-amarelo (o traçado, Figura 1B) e o orifício de rebarba da broca serão visíveis. Se o tecido morto não for visível, provavelmente não ocorreu nenhum derrame. Se o orifício da rebarba não estiver centrado acima do traçado, refira-se para centralizar.</li>
	<li>Oriente a bomba de injeção sobre o mouse e bloqueie a 90°. Limpe a seringa com solução salina estéril ou PBS antes de recarregar o material.<ol>
<li>Uma vez limpo, desmonte a seringa de vidro para que não haja agulha. Encarregar a seringa usando uma pipeta de deslocamento positivo de 25 μL com o 10 μL de hidrogel (ou outro biomaterial aqui com ou sem células).</li>
		<li>Usando o êmbolo da seringa, empurre o gel até a frente da seringa. Em seguida, remonte a seringa e continue empurrando até que o gel exale visivelmente da agulha.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque a seringa na bomba. A parte de trás da bomba pode precisar ser ajustada para que a seringa se encaixe. Faça isso ajustando a taxa de fluxo para 30 μL/min, selecione Retirada ou Inje, dependendo da direção que precisa mover e pressione Iniciar. Aperte Stop quando a parte de trás da bomba estiver no local correto.<ol>
<li>Enrosque a parte de trás da bomba para que a seringa esteja segura. Se os ajustes foram feitos anteriormente, certifique-se de que a taxa de fluxo seja fixada para 1 μL/min e esteja definida para injetar.</li>
	</ol></li>
	<li>Mova a bomba na direção x e y para orientá-la sobre o orifício. Mova a bomba para baixo na direção z até que a agulha da seringa toque a parte superior do orifício.</li>
	<li>Reinicie o z no console de exibição digital. Em seguida, mova a seringa para baixo na direção z 0,750 mm. Se a seringa se curva ou há resistência, o crânio ou curado ou não foi completamente perfurado e precisa ser re perfurado.</li>
	<li>Pressione Inicie o console da bomba para injetar 4 - 6 μL do hidrogel a uma taxa de 1 μL/min.</li>
	<li>Defina um temporizador de 5 minutos quando a bomba parar de injetar para permitir que o gel comece a se cruzar.</li>
	<li>Depois de 5 minutos, puxe lentamente a seringa girando o z nob. Observe para ver se algum material é acidentalmente puxado ou vazando do buraco. Desbloqueie a bomba e mova-a para longe do rato quando a agulha estiver longe o suficiente do crânio.</li>
	<li>Usando fórceps, cola cirúrgica ou suturas, feche a pele acima da cabeça. Coloque o mouse na gaiola limpa e observe sua recuperação. Deve levar cerca de 5 a 10 minutos para o rato se recuperar da anestesia.</li>
</ol>5. Perfusão e coleta de amostras
<ol><li>Anestesiar o rato usando isoflurano.</li>
	<li>Fixar o animal na posição supina e abrir a cavidade abdominal com um corte mediano. Opcionalmente, aperte a aorta abdominal descendente para usar menos fixação e PBS.</li>
	<li>Abra o diafragma e mova as laterais da caixa torácica para abrir a cavidade torácica. Insira uma cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e corte uma abertura no átrio direito. Comece a perfundir lentamente com 10-20 mL de PBS ou até que o líquido seja semi-claro.</li>
	<li>Uma vez claro, mude para 4% PFA para outros 10 – 20 mL. Desempinar as armas permite que eles contraam à medida que o PFA infunde. Assim que pararem de se mover, esperem mais 30.</li>
	<li>Decapitar o animal e puxar a pele para expor o crânio. Usando fórceps finos e bruscos, remova cuidadosamente os pedaços do crânio para expor o cérebro. Cuidados especiais devem ser tomados ao remover o crânio acima do local do derrame. Uma pequena tesoura cirúrgica pode ser usada aqui para ajudar a cortar o crânio. O maior desafio é gel ficar preso ao crânio e sair do cérebro quando o crânio é removido.</li>
	<li>Uma vez que o cérebro é destacado, coloque em 10 - 15 mL de 4% PFA durante a noite (não mais do que 24 horas).</li>
	<li>Mova os cérebros da PFA para 30% de sacarose no dia seguinte. O cérebro está pronto para a crioseção uma vez que afunda até o fundo (cerca de 2 a 3 dias). Ele também pode ser deixado para armazenamento neste momento.</li>
</ol>6. Criosectioning e coloração
<ol><li>Tire o cérebro da sacarose e coloque em uma lâmina de vidro. Corte uma pequena parte da parte de trás do cérebro com uma lâmina de barbear para criar uma porção plana para ser montada em um mandril.<ol>
<li>Coloque um montão de composto de temperatura de corte ideal (OCT) no mandril e, em seguida, coloque o cérebro, lado plano para baixo, sobre o mandril no OCT. Coloque este espécime em gelo seco até congelar ou no criostat no bloco de congelamento. NOTA: O OCT pode ser adicionado para abranger totalmente o cérebro para ajudar a evitar que o material se separe do cérebro durante a secção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte os cérebros em série em um criostat a -20 °C a 30 μm de espessura em 10 lâminas revestidas de gelatina. Tome cuidado ao seção garantindo não perder o hidrogel. Se essa parte for difícil, coloque algum OCT na parte superior do cérebro sobre o gel(Figura 3). Armazene a -80 °C até que use mais.</li>
	<li>Tire lâminas do -80 °C e coloque em uma bandeja de coloração para permitir que elas sequem. Slides que não foram congelados, mas apenas seccionados também podem ser manchados imediatamente.</li>
	<li>Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um círculo em torno das fatias cerebrais no escorregador. Uma vez seco, reidratar as fatias cerebrais com PBS filtrado de 1x e coloque em um agitador à temperatura ambiente por 15 minutos. Isso leva cerca de 1 mL de tampão por slide com 9 - 12 seções cerebrais.</li>
	<li>Lave os slides com PBS filtrado de 1x por 5 minutos à temperatura ambiente, repita três vezes.</li>
	<li>Bloqueie slides por 30 minutos a uma hora com soro de burro de 10% em 0,01% PBS-Triton X à temperatura ambiente na dançarina do ventre. Isso leva cerca de 200 μL por slide.</li>
	<li>Incubar o anticorpo primário em 10% de soro de burro com 0,01% PBS-Triton X durante a noite a 4°C em um shaker. Teste os anticorpos primários primeiro para determinar as concentrações corretas. Aqui foram utilizados GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Figura 4).</li>
	<li>Lave slides com PBS filtrado de 1x no dia seguinte por 5 minutos em temperatura ambiente, repita três vezes.</li>
	<li>Incubar com anticorpo secundário em 10% de soro de burro em 0,01% PBS-Triton X e DAPI por 2 h no agitador de laboratório à temperatura ambiente. 1:1.000 foi usado para todos os secundários e DAPI.</li>
	<li>Lave os slides por 5 minutos com PBS filtrado de 1x.</li>
	<li>Deixe que as seções sequem à temperatura ambiente no escuro. Isso pode levar de 20 min a 4 h; colocar os slides em um desiccator pode acelerar o processo.</li>
	<li>Desidratar slides em concentrações ascendentes de álcool (1 min por solução) de 50%, 70%, 95%, 100% e 100%.</li>
	<li>Desonera no primeiro banho de xileno por 1 min, depois segundo banho de xileno por 5 minutos.</li>
	<li>Retire rapidamente os slides um por um e adicione o meio de montagem enquanto as seções cerebrais estão molhadas com xileno. Adicione rapidamente uma mancha de vidro por cima. Use um deslizamento de tampa que seja de comprimento e espessura corretos necessários para o slide e microscópio utilizados para imagens, respectivamente.</li>
	<li>Livre-se de qualquer bolha sob o deslizamento, pressionando suavemente com uma ponta de pipeta em um movimento externo do centro do slide. Deixe que o DPX seque por 4h a noite no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Use uma lâmina de barbear para raspar qualquer meio de montagem seco que derramou sobre os slides. Limpe os slides com o limpador de lentes. Slides agora podem ser imagens com microscopia de fluorescência. NOTA: É melhor armazenar o slide no escuro ou a 4 °C até que a imagem esteja terminada.</li>
</ol>

<ol>
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P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+growth+and+angiogenesis+around+cortical+stroke.">Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke.</a> Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Neural+Stem+Cells+Contribute+to+Stroke-Induced+Neurogenesis+and+Neuroblast+Migration+toward+the+Infarct+Boundary+in+Adult+Rats.">Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).</li></ol>

Os autores declaram que a TS é fundadora da Tempo Therapeutics, que busca comercializar hidrogéis MAP.

Aqui demonstramos um modelo de derrame facilmente reprodutível, minimamente invasivo e permanente e descrevemos como injetar um biomamaterial no infarto cinco dias após o derrame. O uso do corante fototrombotico Rose Bengala e um laser collimado de 520 nm conectado ao dispositivo estereotaxico nos dá a capacidade de posicionar o curso no córtex motor do mouse com precisão aprimorada. Cinco dias após o derrame, a localização do infarto é visível pelo olho no centro da irradiação, 2,0 mm medio-lateral para o br...

O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos1. Aproximadamente 87% de todos os derrames são isquêmicos, enquanto a maioria dos 13% restantes são hemorrágicos2. Um derrame isquêmico é definido como o bloqueio do fluxo sanguíneo em uma artéria para o tecido circundante. Essa oclusão resulta em privação de oxigênio e necrose subsequente que muitas vezes leva à incapacidade permanente em pacientes sobreviventes. Embora tenha havido uma diminuição na taxa de mortalidade por acidente vascular cerebral3, espera-se que sua prevalência aumente para 3,4 milhões de pessoas até 20304. Esse aumento de sobreviventes com deficiência e consequente carga econômica levou a um impulso para a pesquisa de derrame que se concentra em mecanismos de reparação neural. Após o AVC há um período inflamatório que leva à formação de uma cicatriz que impede a expansão da região necrótica. A região em torno do núcleo necrosado é chamada de "peri-infarto" e há fortes evidências de que a plasticidade nesta região, que inclui o aumento da angiogênese, neurogênese e broto axonal, está diretamente ligada à recuperação observada em modelos animais e humanos5. Como não existem modelos in vitro que possam replicar adequadamente as interações complexas após o AVC, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de avc.
Existem vários modelos in vivo que podem ser usados para produzir derrame isquêmico. Um dos modelos mais comuns utilizados em camundongos é a oclusão da artéria cerebral média, ou MCAo, através da oclusão distal ou proximal (via filamento intra-arterial). O modelo proximal, também conhecido como filamento MCAo (fMCAo), normalmente resulta em grandes derrames isquêmicos que abrangem entre 5% e 50% do hemisfério cerebral, dependentes do número de fatores6. Nesses modelos, uma sutura ou filamento é avançada da artéria carótida interna para a base da artéria cerebral média (MCA) e mantida no lugar por um período específico de tempo. Este método de oclusão, que pode ser feito temporário ou permanente, produz um infarto centrado no estriado e pode ou não envolver o córtex6. O tamanho resultante do acidente vascular cerebral é altamente variável, e técnicas de imagem, como doppler laser, são necessárias para confirmar a eficácia do procedimento em cada rato. A oclusão de filamento intra-arterial ou intra-luminal que dura mais de 30 minutos produz traços na extremidade maior da faixa de tamanho. Alguns investigadores se concentraram em tempos de oclusão de filamentos mais curtos, que requerem foco experimental substancial e validação laboratorial7. Os modelos de Filamento MCAo em camundongos seguem estágios semelhantes de morte celular, progressão isquêmica e formação de uma região peri-infarto, como visto em casos de derrame humano; no entanto, os derrames maiores se assemelham mais ao estado da doença de infartos cerebrais malignos, que são menos comuns, menos tratáveis derrames humanos6. Enquanto isso, a oclusão distal da MCA requer uma cirurgia mais envolvida e craniectomia. Neste modelo, a parte distal do MCA que corre ao longo da superfície do cérebro é diretamente ocluída com uma gravata de sutura ou cauterização. Em algumas variações da técnica, as artérias carótidas são unilateralmente ou transitoriamente ocluídas bilateralmente. Um benefício do MCAo distal é que ele produz um curso de base cortical que é menos variável em tamanho do que o modelo de filamento. No entanto, o modelo distal produz uma produção comportamental mais pobre devido à transeção da artéria carótida externa (ECA), que também é uma preocupação com o FMCAo6.
Um modelo alternativo de avc que é conhecido por ser menos invasivo é o modelo fototrombótico (PT). O modelo PT resulta em um local bem definido de isquemia e está associado a uma alta taxa de sobrevivência8. A técnica conta com um corante fotosensitivo injetado intraperitoneally que permite a fotoper oxidação intravascular simplesmente irradiando o tecido desejado com uma luz ou laser9. Após a excitação, forma-se radicais de oxigênio que causam danos endoteliais, que ativam a agregação de plaquetas e a formação de coágulos na área irradiada8,9. O controle rigoroso sobre o tamanho e a localização do traçado, bem como a alta reprodutibilidade do modelo PT, torna-o ideal para estudar biomateriais. Embora a precisão seja possível usando um laser e coordenadas estereotaxas, existem algumas desvantagens que podem tornar este modelo menos ideal para poucos estudos. Ao contrário do modelo fMCAo, o modelo de traçado PT não pode ser reperrido. Portanto, materiais para investigar agentes neuroprotetores específicos para danos após a reperfusão ou os mecanismos após a reperfusão não seriam úteis aqui8. Além disso, devido ao insulto microvascular do modelo PT, é vista penumbra isquêmica relativamente pequena. Em vez disso, ocorre o edema vasogênico local, que não é característico do AVC humano, tornando este modelo indesejável para estudos de drogas pré-cínicas focados na área peri-infarto6,8.
O objetivo geral das estratégias de biomateriais no AVC é entregar agentes bioativos ou atuar como uma matriz extracelular substituta para o crescimento do tecido cerebral. Uma estratégia que vamos explorar usando nossos métodos é entregar hidrogel diretamente no núcleo do avc, em oposição ao tecido peri-infarto onde muitas terapias celulares atuais são fornecidas10. A justificativa para essa abordagem é que o parto no tecido necrosado encontrado no núcleo evitará interromper o tecido saudável ou em recuperação do ambiente. Assumimos que a difusão de quaisquer agentes ativos incluídos no bioma material será capaz de atingir o peri-infarto do núcleo, especialmente porque descobrimos que a entrega de biomateriais de hidrogel reduz a espessura da cicatrizgliaria 11. Isso é importante, uma vez que a região peri-infarto tem sido mostrada para exibir neuroplasticidade após o AVC, tornando-se um alvo atraente. Além disso, a entrega de uma matriz substituta ao núcleo do avc pode ser carregada com12 ou13 fatores angiogênicos para orientar a formação de novos tecidos, bem como células para o parto14. A entrega celular é muito aprimorada usando uma matriz porque protege as células das duras forças de injeção e do ambiente local presentes durante a entrega, além de incentivar a diferenciação e o enxerto15.
Esses biomateriais terapêuticos injetáveis têm relevância clínica nas aplicações do AVC, pois atualmente não existem terapias médicas que estimulem a recuperação neuronal após o AVC. Os circuitos neurais subjacentes envolvidos na recuperação estão no tecido cerebral adjacente ao núcleo do traçado16,enquanto o próprio núcleo do derrame é desprovido de tecido neural viável. Prevemos que a entrega de um biomamaterial no núcleo do avc necrosado tem potencial para estimular o tecido adjacente em direção a processos regenerativos através de uma série de mecanismos mencionados anteriormente, incluindo a liberação de fatores de crescimento13,estimulação do tecido em crescimento e promoção da recuperação do desenvolvimento do tecido cerebral11,12, alteração das respostas imunes17, e entrega de terapêuticas derivadas de células-tronco14, 18. No entanto, para estudar efetivamente a possibilidade dessas aplicações, é necessário um método consistente e reprodutível para induzir derrame e injetar biomateriais. O modelo de traçado PT utiliza técnicas que oferecem controle preciso sobre a orientação e localização do curso. Um laser ligado ao dispositivo estereotaxic guia orientações, e bombas ligadas aos dispositivos estereotaxicos controlam a taxa de injeção do material sem a necessidade de formas adicionais de imagem. Por isso, optamos por descrever os métodos para a realização de um AVC PT nos córtex motor de camundongos e para injetar biomateriais no núcleo do curso. Aqui, usamos hidrogéis de partículas recadas microporosas (MAP) como o biomamaterial para injeção sem células adicionadas ou fatores de crescimento. Além disso, explicamos como recuperar com sucesso o cérebro com biomaterial intacto, e discutimos ensaios de imunoquímica usados para analisar o resultado do derrame com e sem injeção de biomateriais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-028</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS090735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>14824663</td>
			<td>Syringes used to inject biomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25uL Positive displacement pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Beam Expander, 400-650nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GBE02-A</td>
			<td>Laser beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Stage Platform</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 Antibody, goat</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab5076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12&#34;</td>
			<td>Medsupply</td>
			<td>367294</td>
			<td>For perfusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BKF12- Matte Black Aluminum Foil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BKF12</td>
			<td>To cover anything that is reflective when using laser.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2&#34;</td>
			<td>Sklar surgical instruments</td>
			<td>64-2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8-12 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Assembly Rob</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER3-P4</td>
			<td>3&#34; Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>For creating burr hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM1.01036.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Controller for pigtailed lasers</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CLD1010LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89031-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP 25 pipette tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG H&#38;L (488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-rabbit IgG H&#38;L (647)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-rat IgG H&#38;L (555)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS DPX Mountant</td>
			<td>Elecron Microscopy Sciences</td>
			<td>13512</td>
			<td>Mounting solution for slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16564</td>
			<td>For gelatin coating slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Paraformaldehyde, Granular</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-162</td>
			<td>For making 45 PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESD Worstation kit</td>
			<td>Elmstat</td>
			<td>WSKK5324SB</td>
			<td>Need for setting up the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Bench Wall Plate, unthreaded</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HCA3</td>
			<td>Need for connecting laser to Kopf shaft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiberPort</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PAF-X-5-A</td>
			<td>FC/APC&#38; APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP Antibody, rat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Plate</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>For staining slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Prep Pads</td>
			<td>Medx Supple</td>
			<td>MED MDS093917H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewlers Forceps #5</td>
			<td>GFS chemicals</td>
			<td>46085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Safety Glasses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG10B</td>
			<td>Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck</td>
			<td>United Scope</td>
			<td>LED-11C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical USP Grade Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade</td>
			<td>Intefra Miltex</td>
			<td>V96-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer</td>
			<td>Harvard aparatus</td>
			<td>72-6110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-pump variable flow</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>70730-064</td>
			<td>Pump for perfusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RBMA-200c</td>
			<td>For TTC slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Gas Anethesia Head Holder</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanojet Control Box</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>10050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanojet pump header</td>
			<td>Chemxy</td>
			<td>10051</td>
			<td>Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>NC9459562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-rupture ear bars 60&#186;</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062 338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LP520-MF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charge glass slides</td>
			<td>Hareta</td>
			<td>AHS90-WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power engergy meter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Used to measure your mW laser output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dr. Foster Smith</td>
			<td>9N-76855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal Probe Mouse</td>
			<td>kopf Instruments</td>
			<td>Ret-3-ISO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal Dye 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330000-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2&#34; depth</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1770-02</td>
			<td>For connecting laser to sterotaxic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim photodiode power sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130VC</td>
			<td>Used with power energy meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35&#34; thick 2 Retaining</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP02</td>
			<td>For connecting laser expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10002-726</td>
			<td>To inject rose bengal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StainTray Slide Staining System</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920-2</td>
			<td>For staining slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterotaxic device</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>940</td>
			<td>Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps -1x2 teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps - straight/broad Shanks</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upper Bracket Clamp</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1770-c</td>
			<td>For connecting laser to sterotaxic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhessive 3mL</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-361931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogue Professional My Manicurist</td>
			<td>Bargin Source</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT compound</td>
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			<td>4583</td>
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		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of hydrogel biomaterial scaffolds to the brain after stroke

O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos. Aproximadamente 87% de todos os derrames são derrames isquêmicos e são definidos como o bloqueio repentino de um vaso que fornece sangue ao cérebro. Poucos minutos após o bloqueio, as células começam a morrer e resultam em danos irreparáveis aos tecidos. Os tratamentos terapêuticos atuais se concentram na remoção do coágulo ou na lise para permitir a reperfusão e prevenir danos cerebrais mais graves. Embora a plasticidade cerebral transitória possa salvar parte do tecido danificado ao longo do tempo, frações significativas de pacientes são deixadas com déficits neurológicos que nunca se resolverão. Faltam opções terapêuticas para tratar déficits neurológicos causados pelo AVC, enfatizando a necessidade de desenvolver novas estratégias para tratar essa crescente população de pacientes. Os biomateriais injetáveis estão sendo projetados para melhorar a plasticidade cerebral e melhorar o reparo endógeno através da entrega de agentes ativos ou células-tronco. Um método para testar essas abordagens é utilizar um modelo de curso de roedor, injetar o biomaterial no núcleo do traçado e avaliar o reparo. Saber a localização precisa do núcleo do avc é imperativo para o tratamento preciso após o derrame, portanto, um modelo de derrame que resulte em um local previsível de derrame é preferível para evitar a necessidade de imagem antes da injeção. O protocolo a seguir abordará como induzir um derrame fototrombótico, como injetar um hidrogel de forma controlada e precisa, e como extrair e criosecção do cérebro enquanto mantém o bioma material intacto. Além disso, vamos destacar como esses mesmos materiais de hidrogel podem ser usados para a co-entrega de células-tronco. Este protocolo pode ser generalizado para o uso de outros biomateriais injetáveis no núcleo do traçado.

O objetivo deste método era demonstrar como injetar biomateriais no cérebro após o derrame. Um modelo fototrombótico com bengala rosa e um laser de 520 nm foi utilizado para orientação controlada da lesão do derrame tanto no tamanho quanto na localização. Cinco dias após o derrame, o infarto pôde ser visualizado durante a cirurgia(Figura 1B) e por TTC e imagens de lâminas manchadas de IHC(Figura 2). Um aumento no diâmetro do laser com uma lente 2x l...

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Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

O AVC é um problema global com opções mínimas de tratamento e nenhuma terapia clínica atual para regenerar o tecido cerebral perdido. Aqui descrevemos métodos para criar um derrame fototrombótico preciso no córtex motor de roedores e posterior injeção de biomateriais de hidrogel para estudar seus efeitos na regeneração tecidual após o acidente vascular cerebral.

Injeção de andaimes biomaterial de hidrogel no cérebro após o derrame

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

4.9K visualizações.  Duke University. O AVC é um problema global com opções mínimas de tratamento e nenhuma terapia clínica atual para regenerar o tecido cerebral perdido. Aqui descrevemos métodos para criar um derrame fototrombótico preciso no córtex motor de roedores e posterior injeção de biomateriais de hidrogel para estudar seus efeitos na regeneração tecidual após o acidente vascular cerebral.

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Métodos para Recordings patch-clamp Capacitância da Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biologia

Intravitreous Injection for Establishing Ocular Diseases Model

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as direct application of local treatment. This video introduces how to use simple and inexpensive tools to finish the intravitreous injection procedure. Use of a 1 ml syringe, instead of a hemilton syringe, is used. Practical tips for how to make appropriate injection needles using glass pipettes with perfect tips, and how to easily connect the syringe needle with the glass pipette tightly together, are given.
To conduct a good intravitreous injection, there are three aspects to be observed: 1) injection site should not disrupt retina structure; 2) bleeding should be avoided to reduce the risk of infection; 3) lens should be untouched to avoid traumatic cataract. In brief, the most important point is to reduce the interruption of normal ocular structure. To avoid interruption of retina, the superior nasal region of rat eye was chosen. Also, the puncture point of the needle was at the par planar, which was about 1.5 mm from the limbal region of the rat eye. A small amount of vitreous is gently pushed out through the puncture hole to reduce the intraocular pressure before injection. With the 45&deg; injection angle, it is less likely to cause traumatic cataract in the rat eye, thus avoiding related complications and influence from lenticular factors. In this operation, there was no cutting of the conjunctiva and ocular muscle, no bleeding. With quick and minor injury, a successful intravitreous injection can be done in minutes. 
The injection set outlined in this particular protocol is specific for intravitreous injection. However, the methods and materials presented here can also be used for other injection procedures in drug delivery to the brain, spinal cord or other organs in small mammals.

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research for ocular diseases or as direct application of local treatment. This video demonstrated a protocol for intravitreous injection using a 1ml syringe with glass pipette. Useful tips about avoiding massive bleeding and lens damage are given.

Injeção intravítrea para o Estabelecimento de Modelo de Doenças Ocular

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the gateway to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive processes. It is therefore not surprising that quality of vision is tied to quality of life . Despite widespread clinical and basic research surrounding the causes of visual disorders, many forms of visual impairments, such as retinitis pigmentosa and macular degeneration, lack effective treatments. Non-human primates have the closest general features of eye development to that of humans. Not only do they have a similar vascular anatomy, but amongst other mammals, primates have the unique characteristic of having a region in the temporal retina specialized for high visual acuity, the fovea1. Here we describe a general technique for dissecting the primate retina to provide tissue for retinal histology, immunohistochemistry, laser capture microdissection, as well as light and electron microscopy. With the extended use of the non-human primate as a translational model, our hope is that improved understanding of the retina will provide insights into effective approaches towards attenuating or reversing the negative impact of visual disorders on the quality of life of affected individuals.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of development and aging. The anatomical organization of the primate retina may provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

A entrada para o cérebro: Dissecando o olho Primaz

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Mapear as sequelas de Theta Explosão Estimulação no córtex auditivo humano com Imagem Funcional

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...