Os autores gostariam de agradecer NanoVentures Austrália por apoio de financiamento de viagens e Prof. John Haycock por ter sido sede parcialmente esta pesquisa da Universidade de Sheffield e Ms. Jaimee Mayne por sua ajuda durante as filmagens.

1. Au NRs Preparação Nota: Au NRs pode ser sintetizado por uma série de receitas 16, ou adquiridos de fornecedores comerciais. <ol><li> Medir a densidade óptica inicial (OD) da solução de Au NR via espectroscopia de UV-Vis, por um registo dos valores de absorção de 300 nm a 1000 nm, com uma resolução de 0,5-2 nm. Fazer variar o volume da solução a ser usado com a cuvete disponível. </li><li> Avaliar a concentração molar inicial NP com uma técnica de 17 adequada (por exemplo, UV-Vis, única partícula espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado, microscopia eletrônica de transmissão) ou usar os valores de concentração fornecidos pelo fornecedor. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 5 ml por diluição da amostra inicial de Au NR para atingir uma DO = 1. Para a melhor repetibilidade, manter constante o OD para todas as amostras testadas. Seguir o protocolo do vendedor comercial para a composição do solvente de diluição. Se não tiver certeza, Use água deionizada. </li><li> Centrifugar 1 ml da solução de Au NR duas vezes durante 15 min a 7800 xg para remover qualquer excesso de produto químico a partir da solução. Ciclos de centrifugação podem variar em vigor e tempo (por exemplo, 20 min a 5.600 x g) 18. </li><li> Remover o sobrenadante e re-suspender as NRs em água deionizada. Como partículas re-suspensão pode formar agregados em solução, prepará-los diariamente para ter os melhores resultados. Alternativamente, armazenar em um frigorífico para não mais do que uma semana. Não congelar. </li><li> Antes de utilizar, sob condições de cultura de células, sonicar a solução Au NR durante 5 min e, em seguida esterilizar com luz UV durante 30 minutos (intensidade da radiação UV não menos do que 400 mW ∙ m -2 a 254 nm). </li></ol> 2. NG108-15 celular neuronal Linha Cultura e Diferenciação <ol><li> Para o meio de cultura de células, preparar 500 ml de meio estéril de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) contendo 10% (w / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 1% (w / v) de L-glutamina, 1%(W / v) de penicilina / estreptomicina e 0,5% (w / v) de anfotericina B. Nota: Os suplementos podem ser aliquotado, armazenado a -20 ° C e adicionado ao meio no dia necessária. Meio de cultura celular pode ser refrigerado numa condição estéril durante um período máximo de 1 mês. </li><li> Para o meio de diferenciação celular, preparar 50 ml de DMEM estéril contendo 1% (w / v) de L-glutamina, 1% (w / v) de penicilina / estreptomicina e 0,5% (w / v) de anfotericina B. </li><li> Cresça NG108-15 células neuronais em 10 ml de meio de cultura de células em frascos T75 em poliestireno numa incubadora com uma atmosfera humidificada (5% de CO2 a 37 ° C). Normalmente, sementes 1,5-2 × 10 5 células em cada frasco para estar pronto em 3-4 dias. Mudar meio de cultura celular a cada dois dias. Nota: Para evitar desvios genéticos ou variação, não use as células mais velhas do que a passagem de 21 para experimentos. </li><li> Quando 70-80% confluentes em cultura, mudar o meio com meio de cultura de células frescas quente. Mecanicamente separar as células por suavemente KNOCrei o fundo do frasco confluente. Não use tripsina. </li><li> Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 600 xg e re-suspender o sedimento celular em 2 ml de meio de diferenciação da célula quente. </li><li> Semente 2 × 10 4 células / cm2 em uma cultura de tecidos de poliestireno placa de 96 poços com 200 ul de meio de diferenciação celular. Incubar a experiência durante 1 dia a 5% de CO 2/37 ° C. </li><li> Adicionar entre 3,2 × 10 × 1 -4,2 9 0 10 partículas / ml de solução Au NR no dia 2 e incubar por 24 horas adicionais. Não adicione as partículas para os experimentos de controle. Observação: Como um controlo alternativo, Au PN com um pico de absorção de comprimento de onda bem diferenciado pode ser utilizado para fins de comparação 14. Para um comportamento celular mais consistente, manter a densidade de células constante e não modificar a superfície bem antes da semeadura de células. </li></ol> 3. Aperfeiçoamento crescimento de neurites <ol><li> Casalo laser com uma fibra óptica monomodo (abertura numérica = 0,13) e terminá-lo com um conector de fibra (FC conectores são convenientes e comumente disponíveis). Medir a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão. Para obter os resultados mais eficazes, corresponder ao comprimento de onda de pico do laser para o pico de ressonância de plasmon de NRs. </li><li> No dia 3 após a incubação NR, fixar o conector FC para o bem. Irradiar as amostras e os controlos em TA durante 1 min em onda contínua, para diferentes potências de laser. Permitir que a cultura prosseguir durante mais 3 dias em 5% de CO 2/37 ° C. Repetir a irradiação com laser durante um mínimo de 3 medições independentes. Nota: Diferentes tempos de irradiação e frequências de pulsação pode ser seleccionado, dependendo da aplicação. </li><li> Caracterizar o laser em termos de diâmetro do feixe e irradiação laser (W ∙ cm -2). <ol><li> Para uma fibra monomodo padrão, use NA = n ∙ sin θ,onde n é o índice de refracção do meio em utilização e θ é a metade do ângulo do cone da luz que sai da fibra (ver Figura 1A). De trigonometria, r = tan θ ∙ d, em que r é o raio do feixe e d é a distância entre a fibra e a amostra. O conector FC coincide com o diâmetro do poço, por conseguinte, iluminando a amostra a uma distância d = 2,70 ± 0,20 mm. Luz sai da fibra em água (n = 1,33), dando r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d. </li><li> Usando esta última equação, calcular o raio do feixe laser, o feixe de área correspondente e a irradiação a laser média (potência do laser dividida pela área do feixe) para o alvo (ver o gráfico de exemplo na Figura 1B). Estes valores representam a irradiância média sobre a área iluminada. </li><li> Avaliar os erros para as medições com a teoria geral da propagação de erros. Nota: A distância bntre o conector FC e a amostra pode ser medida por fotografias do arranjo experimental e de pós-processamento da imagem utilizando software apropriado (por exemplo ImageJ). </li></ol></li><li> No dia 5, remover o meio de diferenciação de células a partir das experiências e fixar as amostras com 3,7% (v / v) de solução de formaldeído, durante 10 min, em seguida, permeabilizar as células com 0,1% (v / v) de Triton X-100 durante 20 min. </li><li> Adicionar 3% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) para as amostras durante 60 minutos para bloquear os locais de ligação da proteína que não reagiu. Rotular as amostras durante a noite para anti-βIII-tubulina (5 ug / ml em PBS suplementado com 1% de BSA) a 4 ° C. </li><li> Incubar as células durante 90 min no escuro com um anticorpo secundário apropriado (anticorpo de ratinho anti-TRITC por exemplo conjugado de IgG) utilizando uma concentração de 0,4-2 ug / ml em 1% de BSA em PBS. Rotular os núcleos celulares com DAPI (0,1 ug / ml em água desionizada) durante 10 min. Nota: conjugação de anticorpos e mig concentraçãoht variar de acordo com o protocolo da empresa. Lavar as amostras duas vezes com PBS durante 5 min após cada etapa de coloração. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li> Amostras de imagem por epifluorescência ou microscopia confocal, utilizando pelo menos um 20 × objetivo. Escolha do microscópio filtra em conformidade com o anticorpo secundário. Selecione um filtro de DAPI (λ EX = 358 nm; λ EM = 488 nm) para visualizar os núcleos celulares. </li><li> Analisar as imagens por avaliar: i) o comprimento de neurites máximo (ficha o comprimento da ponta da neurites para o início do corpo celular), ii) o número de neurites por célula neuronal (resumir todas as neurites por célula) e iii) a percentagem de células com neurites (dividindo o número total de células que expressam βIII-tubulina pelo número total de células com um núcleo corou positivamente) 19. </li></ol> 4. laser-induzida intracelular de Ca2 + de imagem <ol&gt; <li> Prepara-se uma a 20% (w / v) de solução de estoque de Pluronic F-127 por dissolução de 2 g de soluto em 10 ml de dimetilsulfóxido anidro (DMSO). Aquece-se a solução de Pluronic F-127 a 40 ° C durante cerca de 20 min para aumentar a solubilidade. Prepare com antecedência se armazenado à temperatura ambiente. </li><li> No dia 3 seguinte NR incubação, preparar uma solução de sal equilibrada (BSS; NaCl 135 mM, KCl 4,5 mM, CaCl 2 1,5 mM, MgCl 2 0,5 mM, glicose 5,6 mM, e 10 mM de HEPES, pH 7,4) e complementado com 5 ? M de Fluo-4 AM durante DMSO e 0,1% (w / v) de Pluronic F-127 solução. Nota: solução de BSS pode ser preparado antecipadamente e refrigerados durante um período máximo de 1 mês. Adicione os suplementos (Fluo-04:00 e Pluronic F-127) no dia do experimento. </li><li> Remova o meio de diferenciação celular e substituí-lo com a solução de BSS suplementado. Para obter os melhores resultados com um microscópio confocal invertido, incubar as células em um micro-poços da lâmina. </li><li> Carga NG108-15 células com Fluo-04:00durante 30 min no escuro a 5% de CO 2/37 ° C. Após o tempo de incubação, as amostras lavar duas vezes com BSS para remover qualquer fluoróforo descarregado extracelular. </li><li> Pares a laser com uma fibra óptica de modo simples e clivar a ponta, utilizando técnicas convencionais. Observar a ponta resultante sob um microscópio óptico, para assegurar uma superfície de alta qualidade (ou seja, a ponta deve ser perpendicular ao eixo da fibra e plana sobre a inspecção microscopia). <ol><li> Medir a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão. Insira o fibra entrega a luz em um suporte de fibra óptica e afixá-lo a um microposicionador. Consulte Brown et al. 20 para obter mais detalhes sobre a preparação de fibra óptica e de posicionamento. Atenção: Siga as regras gerais de segurança do laser durante a medição da potência do laser (por exemplo, não olhe diretamente para o feixe de laser, usar óculos de segurança a laser durante o manuseio, evitar a exposição a luz difusa para outros usuários de laboratório) &lt;./ Li&gt; </ol></li><li> Ligue um osciloscópio para o laser portátil para monitorar a modulação óptica. Use um sinal binário com freqüências variáveis ​​(0,5-2 Hz) e comprimentos de pulso (20-100 ms). Ligue o laser utilizando o sinal de modulação como a lógica transistor-transistor (TTL) de entrada para o microscópio, após a configuração mostrada na Paviolo et al. 13. <ol><li> Colocar as células sob um microscópio confocal invertido e posicionar a fibra de entrega de luz 250 ± 50 mm de distância a partir da célula alvo em modo de iluminação de transmissão. A esta distância, utilizar as equações apresentadas em 3.3.1 para calcular o raio do feixe para o alvo. </li></ol></li><li> Usar um laser de árgon-ião (488 nm) para excitar o corante Fluo-4 AM internalizado (λ EX = 494 nm; λ EM = 516 nm) e o LD sincronizado para a excitação de NRs endocitose. Realize a imagem de TR de amostras e controles usando pelo menos um objectivo de 40 ×, recolhendo scans de séries temporaiscom 256 × 256 pixels / resolução de quadro no modo de ida e volta, com uma frequência de pelo menos 4 Hz. Realizar uma gravação sem qualquer excitação LD para identificar qualquer interferência com laser de argônio-ion (ruído da linha de base). </li><li> Retire o fundo a partir dos dados utilizando adaptativa ponderados penalizados mínimos quadrados algoritmos 21. Traçar as variações induzidas Ca2 + como uma função do tempo. Analisar os picos transientes na intensidade de fluorescência, utilizando software de imagem pós-processamento por thresholding a um nível de três vezes o desvio padrão do ruído de linha de base (3σ). </li></ol>

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	<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stimulation+with+optical+radiation.">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).</li><li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes.">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).</li><li>Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+ion+channels+and+neurons+through+magnetic-field+heating+of+nanoparticles.">Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles.</a> Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).</li><li>Farah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographically+patterned+activation+using+photo-absorber+induced+neural-thermal+stimulation.">Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation.</a> J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).</li><li>Ciofani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+neuronal-like+cells+following+boron+nitride+nanotube-mediated+stimulation.">Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation.</a> ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+by+iron+oxide+nanoparticles.">Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).</li><li>Myroshnychenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+optical+response+of+gold+nanoparticles.">Modelling the optical response of gold nanoparticles.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).</li><li>Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+cancer+therapy+and+imaging+based+on+gold+nanorods.">Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).</li><li>Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+mesoporous+silica-encapsulated+gold+nanorods+as+enhanced+light+scattering+probes+for+cancer+cell+imaging.">A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging.</a> Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).</li><li>Paviolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+increase+neuronal+cell+outgrowth.">Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).</li><li>Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+induce+intracellular+calcium+transients.">Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients.</a> J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).</li><li>Yong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-nanorod-assisted+near-infrared+stimulation+of+primary+auditory+neurons.">Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons.</a> Adv. Healthcare Mater. , (2014).</li><li>Eom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infrared+neural+stimulation+using+localized+surface+plasmon+resonance+of+gold+nanorods.">Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods.</a> Small. , (2014).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+Synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications.</a> Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+separation+of+gold+nanorods+using+centrifugation.">Shape separation of gold nanorods using centrifugation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).</li><li>Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+site+influences+the+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells+for+schwann-cell+phenotype+and+function.">Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function.</a> Glia. 59 (5), 734-749 (2011).</li><li>Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+for+investigating+the+mechanisms+of+infrared+neural+stimulation.">Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation.</a> JoVE. (77), (2013).</li><li>Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+fluorescence+background+subtraction+from+Raman+spectra.">Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra.</a> J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).</li><li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies.">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+gold+nanoparticles+increase+neuronal+excitability+and+aggravate+seizure+activity+in+the+mouse+brain.">Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain.</a> PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).</li><li>Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+extracellular+application+of+gold+nanostars+increases+hippocampal+neuronal+activity.">Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity.</a> J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).</li><li>Ebbesen, C. L., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+laser-induced+heating+in+optical+neuronal+guidance.">Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance.</a> J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).</li><li>Iwanaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location-dependent+photogeneration+of+calcium+waves+in+HeLa+cells.">Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+minimum+temperature+required+for+selective+photothermal+destruction+of+cancer+cells+with+the+use+of+immunotargeted+gold+nanoparticles.">Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles.</a> Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).</li><li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity.">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li><li>Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subacute+and+chronic+toxicity+of+cetyltrimethylammonium+bromide+(CTAB),+a+cationic+surfactant,+in+the+rat.">The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat.</a> Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: synthesis, characterization and applications.</a> Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+golden+age:+gold+nanoparticles+for+biomedicine.">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+photothermal+therapy+(PPTT)+using+gold+nanoparticles.">Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles.</a> Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).</li><li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons.">TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).</li><li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent+rearrangement+of+TRPV4+cytosolic+tails+enables+channel+activation+by+physiological+stimuli.">Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), (2012).</li><li>Roggan, A., Friebel, M., D&#246;rschel, K., Hahn, A., M&#252;ller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm.">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=810+nm+wavelength+light:+an+effective+therapy+for+transected+or+contused+rat+spinal+cord.">810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord.</a> Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li><li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures:+involvement+of+reactive+oxygen+species.">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li><li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase.">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li><li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver:+a+theoretical+and+practical+approach.">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

Os protocolos descritos nesta apresentação descrevem como cultura, diferenciar e opticamente estimular as células neuronais usando absorventes extrínsecos. As características NR (por exemplo, dimensões, forma, comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície e química) e os parâmetros de estimulação do laser (comprimento de onda, tais como, duração dos impulsos, taxa de repetição, etc.) pode ser variada para corresponder a diferentes necessidades experimentais. Os efeitos sob...

Estudos recentes têm demonstrado que o aquecimento transitória associada com a absorção de luz infravermelha por água (comprimento de onda&gt; 1400 nm) pode ser utilizado para induzir potenciais de acção em tecidos nervosos 1 e transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos 2. A utilização de luz infravermelha tem suscitado grande interesse para aplicações em próteses neurais, devido ao potencial de resolução espacial mais fina, a falta de um contacto directo com o tecido, a minimização de artefactos de estimulação, e remoção da necessidade de modificar geneticamente as células antes da estimulação ( conforme exigido no optogenética) 1. Apesar de todas estas vantagens, os modelos térmicos desenvolvidos recentemente sugerido que os tecidos / células-alvo pode ser afectada por efeitos cumulativos de aquecimento, quando vários sítios de estímulo e / ou elevadas taxas de repetição são utilizados 3,4. Em resposta a estes desafios, os pesquisadores têm reconhecido o potencial de usar unidade de absorvância extrínsecabros para a estimulação do nervo para produzir efeitos de aquecimento mais localizadas no tecido. Huang et al. Demonstrou esse princípio usando nanopartículas de ferrita superparamagnéticos para ativar remotamente os canais TRPV1 sensíveis à temperatura em células HEK 293 com um campo magnético 5 de rádio-freqüência. Embora esta técnica pode permitir a penetração mais profunda (campos magnéticos relativamente interagem fracamente com o tecido), apenas as respostas foram registadas ao longo de períodos de segundos, em vez de as durações milissegundo necessários em dispositivos biônicos 5. Da mesma forma, Farah et al. Estimulação elétrica demonstrada de neurônios corticais de ratos com micro-partículas negras em vitro. Eles mostraram precisão em nível celular em estimulação usando durações de pulso na ordem de centenas de ms e energias na faixa de μJ, potencialmente permitindo que as taxas de repetência mais rápidos 6. A utilização de absorventes extrínsecos também foi aplicado para induziralterações morfológicas in vitro. Ciofani et al. Mostrou um aumento de ~ 40% no crescimento de células neuronais usando nanotubos de nitreto de boro piezoelétricos excitados por ultra-som 7. Da mesma forma, nanopartículas de óxido de ferro endocitose nas células PC12 têm sido relatados para aumentar a diferenciação de neurites de uma forma dependente da dose, devido à activação de moléculas de adesão celular, com o óxido de ferro 8. Recentemente, o interesse em absorvedores extrínsecos para ajudar a estimulação neural também centrou-se na utilização de nanopartículas de ouro (Au NPS). Au NPs têm a capacidade de absorver a luz laser de forma eficiente no pico plasmónico e dissipar para o ambiente circundante em forma de calor 9. Entre todas as formas de partículas disponíveis, a absorção óptica do nanorods ouro (Au NRs) corresponde convenientemente a janela terapêutica de tecidos biológicos (infravermelho próximo - NIR, comprimento de onda entre 750-1,400 nm) 10. Além disso, no context de estimulação neural, o uso de Au NRs proporciona biocompatibilidade relativamente favoráveis ​​e uma grande variedade de opções de funcionalização de superfície 11. Estudos recentes têm mostrado que um efeito estimulador sobre a diferenciação pode ser induzida após exposições a laser contínua de Au NRs NG 108-15 em células neuronais 12. Da mesma forma, os transientes de cálcio intracelular foram registrados em células neuronais cultivadas com Au NRs após a irradiação com laser modulado com freqüências variáveis ​​e pulso comprimentos 13. Despolarização da membrana celular também foi registada após iluminação por laser NIR de Au NRs em culturas primárias de neurónios do gânglio da espiral 14. A primeira aplicação in vivo com irradiado Au NRs foi demonstrado recentemente. Eom e colegas de trabalho expostos Au NRs em seu pico plasmonic e registrou um aumento de seis vezes na amplitude do potencial de ação do nervo composto (CNaPS) e uma diminuição de três vezes no limiar de estimulação no nervo ciático de ratos. O enresposta hanced foi atribuído a efeitos de aquecimento local que resultam da excitação do pico plasmónico NR 15. No presente trabalho, protocolos para investigar os efeitos da estimulação do laser em NG108-15 células neuronais cultivadas com Au NRs são especificados. Esses métodos fornecem um simples, mas poderoso, caminho para irradiar populações de células in vitro utilizando técnicas de biologia padrão e materiais. O protocolo baseia-se em um diodo laser acoplada a fibra (LD) que permite um funcionamento seguro e repetitivo alinhamento. As Au NR preparação de amostras e métodos de irradiação a laser pode ser alargada a diferentes formas de partículas e culturas de células neuronais, proporcionando que os protocolos de síntese e de cultura específicos são conhecidos, respectivamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Au NR</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>716812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG108-15</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8811230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrometer</td>
			<td>Varian Medical Systems Inc.</td>
			<td>Cary 50 Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mini Spin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic bath</td>
			<td>Unisonics Australia</td>
			<td>FPX 10D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Hera Cell 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotofix 32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser diode</td>
			<td>Optotech</td>
			<td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>780 HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Laser Check</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>ImageX-press 5000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-slide well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td>
			<td>LSM 510 meta-confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

Usando protocolos 1, 2 e 3 descritos aqui, um efeito estimulador sobre a diferenciação foi observada em células NG108-15 neuronais cultivadas com Au PN (Au NRs, poli (estirenossulfonato) -Revestido Au NRs e revestido de silica Au NRs) após o laser exposições entre 1,25 e 7,5 W · cm -2. Imagens confocal de rhodamineB marcado Au NRs demonstrado que as partículas foram internalizadas desde o dia 1 de incubação de 12. A localização foi predominantemente observada no citoplasma da célula, i...

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Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K visualizações.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.