Esta pesquisa foi financiada por meio de bolsas obtidas da Fundação Sueca do Câncer (Cancerfonden, CAN2017/518), da sociedade sueca de pesquisa médica (SSMF, S17-0092), da fundação O.E. och Edla Johanssons e da fundação Olga Jönssons.  Essas fontes de financiamento não estavam envolvidas no desenho do estudo; coleta, análise e interpretação dos dados; redação do relatório; e na decisão de submeter o artigo para publicação. A impressão 3D de espaçadores personalizados usados neste protocolo foi realizada na U-PRINT: a instalação de impressão 3D da Universidade de Uppsala no Domínio Disciplinar da Medicina e farmácia, U-PRINT@mcb.uu.se. Gostaríamos de agradecer a Paul O'Callaghan por sua valiosa contribuição em nosso projeto.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig1.jpg"> Figura 1: Representações gráficas da criação do modelo HCC biomimético 3D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NOTA: O fluxo de trabalho global deste protocolo está definido nas ilustrações da Figura 1
1. Preparação da solução de estoque fibrinogênico
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de 1 M de cloreto de cálcio (CaCl2),pesando 2,21 g CaCl2 e adicionando-a a 20 mL de água destilada (dH2O). A solução de estoque pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de aprotinina de 20 mL (1218,75 KIU/mL) pesando 5 mg de aprotinina e adicionando-a a 20 mL dH2O. Solução de estoque aliquot em alíquotas de 1 mL e armazenar a -20 °C.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque fibrinogênico de 10 mL de 80 mg/mL.<ol>
<li>Em um tubo de 50 mL adicione 7.849 mL de salina tamponada de fosfato (PBS), 2,051 mL aprotinina (1218,75 KI LU/mL) para uma concentração final de aprotinina de 250 KIU/mL e 100 μL CaCl2 (1M) para uma concentração final de CaCl2 de 10 mM.</li>
		<li>Pesar 800 mg de fibrinogênio.</li>
		<li>Pesar 200 mg de cloreto de sódio (NaCl) para que a solução de estoque contenha 2% de c/v NaCl.</li>
		<li>Adicione o fibrinogênio e o NaCl em incrementos ao tubo de 50 mL contendo o PBS, aprotinína e CaCl2. Não mexa ou agite vigorosamente, pois isso resultará em gelagem de fibrinogênio e emperramentos se formando na solução.</li>
		<li>Coloque o tubo de 50 mL da solução de caldo fibrinogênico horizontalmente em um agitador e agite a uma configuração baixa de 300 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que a solução tenha dissolvido, filtre-a usando um filtro de seringa de 0,22 μm ou um filtro de topo de garrafa, dependendo do volume. É importante ressaltar que não autoclave a solução fibrinogênio, pois isso destruirá o fibrinogênio. NOTA: Esta parte do protocolo pode levar entre 2 a 5 h, dependendo da quantidade de solução de estoque, este tempo deve ser levado em consideração durante a configuração experimental.</li>
</ol>2. Revestimento insere com colágeno antes de semear os hidrogéis nas pastilhas
<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar ou uma capa de cultura de tecido, usando pinças esterilizadas, remova as pastilhas da placa e coloque invertido na tampa da placa.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de ácido acético glacial de 100 mL adicionando 115 μL de ácido acético glacial a 25 mL de dH2O e ajuste a um volume final de 100 mL com dH2O. Filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,22 μm. A solução de estoque pode ser armazenada na RT.</li>
	<li>Prepare 2 mL de uma solução de colágeno de 100 μg/mL a partir de uma solução de colágeno de 5 mg/mL adicionando 40 μL da solução de colágeno de 5 mg/mL a 1.960 mL da solução de 20 mM de ácido acético glacial preparada em 2,2.</li>
	<li>Cubra as pastilhas com a solução de colágeno de 100 μg/mL preparada em 2,3 por pipetação de 100 μL da solução em cada inserção. Deixe inserir ar seco dentro da capa de fluxo laminar ou da capa de cultura de tecido por 2 a 3 horas.</li>
	<li>Uma vez que as pastilhas tenham lavado seco cada inserção 3x com PBS. Adicione 1 mL de PBS a cada poço de uma placa de 12 poços, coloque as pastilhas com revestimento de colágeno voltado para baixo nos poços, retire o PBS do poço e repita o procedimento. Deixe inserir ar seco dentro do capô de fluxo laminar de 1 a 2 h. ATENÇÃO: O ácido acético é tóxico para as células e as pastilhas devem ser lavadas completamente com PBS.</li>
	<li>Adicione um espaçador impresso 3D personalizado sobre as pastilhas, isso será necessário uma vez que os géis estejam pendurados na pastilha para evitar que toquem no poço inferior da placa(Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig2.jpg"> Figura 2: Espaçador impresso 3D personalizado <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="7"><li>Cubra as pastilhas invertidas com a parte inferior da placa e coloque na incubadora até que as células estejam embutidas nos hidrogéis e prontas para serem semeadas.</li>
</ol>3. Células de semeadura embutidas em hidrogéis em pastilhas
NOTA: A Tabela 1 fornece uma descrição de 3 formulações com concentrações variadas fibrinogenas que serão preparadas. Formulação uma corresponde ao fígado durante o início da fibrose, duas cirrose e três HCC, os valores de rigidez para cada uma dessas formulações foram determinados com reologia durante a otimização do protocolo.
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulação</td>
			<td>Concentração final de fibrinogênio (mg/mL)</td>
			<td>Concentração final de colágeno (mg/mL)</td>
			<td>Células (LX2 + HepG2 Co-cultura 1:1)</td>
			<td>Estágio do fígado</td>
			<td>Valores de rigidez hepática da literatura (kPa)</td>
			<td>Valor de rigidez do modelo de Reologia (kPa)</td>
			<td>Formulação</td>
			<td>Fibrinogen para adicionar (mL)</td>
			<td>Colágeno para adicionar (mL)</td>
			<td>10 % DMEM (mL)</td>
			<td>Trombina (μL)</td>
			<td>
Referências</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 células/mL</td>
			<td>Fibrose</td>
			<td>≥2</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4</td>
			<td>28; 29; 30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 células/mL</td>
			<td>Cirrose</td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>2</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.45</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 células/mL</td>
			<td>Hcc</td>
			<td>≥10</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1</td>
			<td>28; 31; 32</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Descrição das formulações para células semeadas embutidas em hidrogéis em pastilhas
<ol><li>Prepare a solução de caldo hidróxido de sódio de 1 M adicionando 3,99 g de NaOH a 100 mL de dH2O.  A solução pode então ser filtrada usando um filtro de seringa de 0,22 μm. Armazene a solução de estoque na RT.</li>
	<li>Coloque o colágeno de 5 mg/mL e 10 mL de 1 M NaOH no gelo.</li>
	<li>Pré-aqueça 50 mL PBS, 15 mL trypsin, 70 mL 10% DMEM, e solução de estoque fibrinogênico, preparada na seção 1, a 37 °C por 20 minutos em banho-maria.</li>
	<li>Prepare as suspensões das células.<ol>
<li>Lave células estelares hepáticas (LX2) e carcinoma hepático (HepG2) em frascos de cultura T175 duas vezes com 10 mL de PBS.</li>
		<li>Células de trypsinize com trippsina de 6 mL por 4 min a 37 °C.</li>
		<li>Inativar trippsina com 6 mL de 10% de DMEM.</li>
		<li>Colete a suspensão celular em tubo de 15 mL e centrífuga por 3 min a 300 x g.</li>
		<li>Após a centrifugação, aspire o supernaspe e resuspenda cada linha celular em 5 mL de 10% DMEM.</li>
		<li>Conte as células usando um contador automático de células: Adicione 10 μL de cada suspensão celular ao slide da câmara de contagem e insira o slide no balcão da célula. A contagem de células é exibida como células/mL.</li>
		<li>Diluir as células de cada linha celular para 1 x 106 células por mL usando a contagem de células na etapa 3.4.6 em tubos claramente marcados de 15 mL. Centrifugar as diluições por 3 min a 300 x g.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a centrifugação, aspire o supernasce e adicione 10% de DMEM a cada tubo de 15 mL de acordo com a Tabela 1, os valores fornecidos na Tabela são para 2 mL de cada formulação.</li>
	<li>Neutralizar a quantidade de colágeno com 10 μL/mL NaOH (1 M), e adicionar o colágeno neutralizado à suspensão da célula, o presente de 10% DMEM ficará amarelo, uma vez que a suspensão é completamente misturada por pipetação com uma ponta de corte ele vai ficar um rosa brilhante.</li>
	<li>Adicione fibrinogênio à suspensão da célula de colágeno de acordo com a Tabela 1, usando uma ponta de pipeta cortada, misture bem a suspensão.</li>
	<li>Por fim, adicione trombina à suspensão de células de colágeno-fibrinogênio, trombina KIU de 0,1 KIU para cada 10 mg de fibrinogênio.</li>
	<li>Remova as pastilhas invertidas pré-revestidas preparadas na seção 2 da incubadora e utilizando uma ponta de pipeta de 200 μL cortada, pipeta 200 μL da suspensão preparada nas pastilhas designadas. Deixe os géis atravessarem por 15 minutos dentro do capô de fluxo laminar.</li>
	<li>Depois de 15 min, coloque suavemente a parte inferior da placa sobre os géis e mova-os para a incubadora para permitir que os géis cruzem a 37 °C por 45 min.</li>
	<li>Uma vez que os géis tenham cruzado, inverta as pastilhas novamente e adicione 2 mL de 10% DMEM a cada um dos poços inferiores da placa.</li>
</ol>4. Semeando células endoteliais
<ol><li>Solução de sal balanceada de 25 mL hanks (HBSS), 10 mL trypsin, 10 mL inibidor de trippsina e 50 mL de crescimento endotelial médio, até 37°C por 20 minutos em banho-maria .</li>
	<li>Prepare a suspensão celular endotelial (HUVEC).<ol>
<li>Lave as células HUVEC em frascos de cultura T175 duas vezes com HBSS de 10 mL.</li>
		<li>Células de trypsinize com trippsina de 6 mL por 4 min a 37 °C. Inativar trippsina com inibidor de trippsina de 6 mL. Colete a suspensão celular em 15 mL de tubo e centrífuga por 3 min a 200 x g.</li>
		<li>Após a centrifugação aspirar o supernasciente e suspender as células em meio de crescimento endotelial de 5 mL.</li>
		<li>Conte as células como descrito anteriormente em 3.4.6 usando um contador de células automatizado.</li>
		<li>Usando a contagem de células do contador celular, prepare a densidade de semeadura de 1,0 x 104 células/mL em meio de crescimento endotelial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semente 500 μL da suspensão da célula HUVEC em cada poço da parte superior da inserção para ter um volume final de 5,0 x 103 células por inserção.</li>
</ol>5. Manutenção
<ol><li>Substitua o meio de crescimento a cada dois dias, aspirado ao meio de crescimento gasto tanto do poço quanto da inserção. Adicione 2 mL 10% DMEM aos poços que contêm o gel e meio de crescimento endotelial de 0,5 mL às pastilhas que contêm as células HUVEC.</li>
	<li>Mantenha o modelo por 21 dias antes da experimentação.</li>
</ol>6. Reologia
<ol><li>Medir o moduli de armazenamento das formulações de gel para indicar valores de rigidez usando um reômetro, realizando varreduras de frequência de 0,1-20 Hz a 0,267% e 37°C, com uma força axial constante de 0,1N usando uma geometria de aço inoxidável de placa paralela de 8 mm de diâmetro.</li>
</ol>7. Viabilidade e resposta a medicamentos
<ol><li>Determine a resposta e viabilidade da droga em co-culturas 2D e modelo 3D.<ol>
<li>Seed HepG2 (5.0 x 103 células/mL) e LX2 (5,0 x 103 células/mL) em uma proporção de 1:1 para a cocultura 2D em um fundo preto claro 96-well placas a uma densidade semeada de 1,0 x 104 células/mL.  Permitir que as células se conectem durante a noite.</li>
		<li>Configure o modelo 3D para corresponder a um ambiente cirrótico com um valor de rigidez de 6 kPa.  Mantenha o modelo por 21 dias antes do tratamento com Doxorubicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Duas horas antes do tratamento da doxorubicina, aspire o meio de cultura tanto do modelo 2D quanto 3D. Lave os dois modelos duas vezes com PBS. Adicione o meio de fome (DMEM suplementado com solução antimíctica antimíctica de 1% v/v) à cocultura 2D (200 μL por poço) e ao modelo 3D (2 mL aos poços que contêm o hidrogel e 500 μL à inserção).</li>
	<li>Administre a doxorubicina tanto no modelo 2D quanto no 3D.  As doses são as seguintes: 0,5, 1 e 1,5 mM correspondentes aos valores IC25, 50 e 75, respectivamente.  Trate ambos os modelos por 72 h. NOTA: A doxorubicina, inibidora de topoisomerase II, é uma das primeiras drogas quimioterápicas utilizadas para o HCC e também é um dos agentes quimioterápicos mais ativos no tratamento do HCC33,34.</li>
	<li>Após 72 h, média de cultura aspirada tanto do modelo 2D quanto 3D. Certifique-se de que qualquer meio de cultura restante seja removido lavando ambos os modelos duas vezes com PBS.</li>
	<li>Prepare a AlamarBlue de acordo com as recomendações do fabricante e adicione aos poços do modelo 2D e 3D. Adicione 150 μL por poço para a cultura 2D e 2 mL por poço e 500 μL por inserção para cultura 3D.  Incubado durante a noite a 37°C.</li>
	<li>Após a transferência de incubação 150 μL do AlamarBlue de cada poço da configuração 3D em uma placa de fundo claro preto de 96 poços. AlamarBlue pode ser lido diretamente da placa para o modelo 2D.</li>
	<li>Leia a fluorescência com um leitor de microplaca no comprimento de onda de excitação e comprimento de onda de emissão de 485 e 550 nm, respectivamente.</li>
	<li>Calcule a viabilidade celular percentual em ambos os modelos usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61606/61606eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).</li><li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+spheroids+exhibit+stable+physiological+functionality+for+at+least+24+days+after+recovering+from+trypsinisation.">Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation.</a> Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+of+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+3D+bioprinting+of+decellularized+extracellular+matrix+with+regionally+varied+mechanical+properties+and+biomimetic+microarchitecture.">Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture.</a> Biomaterials. 185, 310-321 (2018).</li><li>Mueller, S., Sandrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stiffness:+a+novel+parameter+for+the+diagnosis+of+liver+disease.">Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease.</a> Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).</li><li>Wang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+liver+stiffness+in+a+rat+model+of+hepatic+fibrosis+with+acoustic+radiation+force.">In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).</li><li>Georges, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+liver+stiffness+of+the+rat+liver+precedes+matrix+deposition:+implications+for+fibrosis.">Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).</li><li>Massironi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+Liver+stiffness+and+hepatocellular+carcinoma:+is+it+really+useful.">et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful.</a> Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stiffness+is+associated+with+risk+of+decompensation,+liver+cancer,+and+death+in+patients+with+chronic+liver+diseases:+A+systematic+review.">Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).</li><li>Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+and+doxorubicin+for+the+treatment+of+patients+with+advanced+hepatocellular+carcinoma:+a+phase+I-II+trail.">Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail.</a> Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).</li><li>Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+for+hepatocellular+carcinoma:+the+present+and+the+future.">Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future.</a> World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).</li><li>Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cues+guiding+matrix+stiffness+in+liver+fibrosis.">Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis.</a> BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).</li><li>Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-related+proteins+in+tissue+repair:+how+a+unique+domain+with+common+structure+controls+diverse+aspects+of+wound+healing.">Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing.</a> Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).</li><li>Smit, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+alginated+encapsulated+LS180+spheroid+model+for+anti-colorectal+cancer+compound+screening.">Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).</li><li>Schrader, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+modulates+proliferation,+chemotherapeutic+response,+and+dormancy+in+hepatocellular+carcinoma+cells.">Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells.</a> Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).</li><li>Lachowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+modulates+the+activity+of+MMP-9+and+TIMP-1+in+hepatic+stellate+cells+to+perpetuate+fibrosis.">Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis.</a> Scientific Reports. 9, 7299 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um método para criar um modelo biomimético para hcc. Um fluxo de trabalho claro foi estabelecido e as etapas críticas envolvidas foram identificadas. Essas etapas críticas incluem a preparação da solução de estoque de fibrinogênio, o revestimento das pastilhas com colágeno e a semeadura das células embutidas no hidrogel. Durante a preparação da solução de estoque de fibrinogênio é importante adicionar o fibrinogênio em incrementos menores em concentrações mais altas. Isso não só reduzirá o tempo necessário para que o fibrinogênio se dissolva, mas também impedirá que o fibrinogênio de geleia de forma inconsistente e prematura, como visto na Figura 11. A preparação do gel de fibrinogênio leva um tempo considerável e isso pode influenciar o sucesso experimental global. Os resultados indicam que uma vez que o gel de fibrinogênio começa a gelar inconsistentemente é melhor descartá-lo. As pastilhas devem ser revestidas com colágeno, lavadas com PBS e secas dentro da coifa de fluxo laminar antes de semear as células embutidas em hidrogéis. A falha em garantir que as pastilhas estejam secas resultará no derramamento de hidrogéis sobre as bordas da pastilha, resultando em um gel irregular. A irregularidade do gel influenciará, em última análise, os resultados onde a difusão é um fator.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig11.jpg"> Figura 11: Preparação de gel de fibrinogênio para formulações de hidrogel fibrinogênio/colágeno. (A) Solução de gel de fibrinogen que formou aglomerados e começou a gelar prematuramente com fibrinogênio não resolvido aderindo ao tubo. (B) Solução de gel de fibrinogen que se dissolveu completamente, a solução é clara e ligeiramente mais viscosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Recomenda-se trabalhar o mais rápido possível enquanto semeia a suspensão da célula de hidrogel nas pastilhas, pois o componente fibrinogênio começará a cruzar com a adição de trombina.  Prepare volumes de trabalho menores ao trabalhar com suspensões de gel em concentrações mais altas para evitar que o gel entre em tração cruzada durante a semeadura. Este último terá um efeito sobre a distribuição e a quantidade de gel semeado em cada poço. A ordem de adição dos componentes é fundamental, neste protocolo fornecemos um fluxo de trabalho simplificado para evitar que os géis cruzem prematuramente.  Devido à viscosidade da suspensão do gel de hidrogel que trabalha com uma ponta de pipeta cortada é aconselhável durante a mistura e medição.  Ao misturar a suspensão certifique-se de que isso seja feito de forma rápida e uniforme para criar uma suspensão homogênea. A mistura desigual resultará em um gel heterogêneo que afetará negativamente os resultados, ver Figura 12.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig12.jpg"> Figura 12: Géis de colágeno/fibrinogênio semeados em 12 placas de poço. Todos os géis semeados em um volume de 200 μL contendo colágeno de 2mg/mL e fibrinogen de 20 mg/mL com 2,0 x 106 células/mL. (A) Gel de hidrogel com consistência heterogênea, distribuição irregular visível dos hidrogéis. (B) Hidrogels homogeneamente misturados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Após a otimização do protocolo, o modelo foi avaliado para determinar as propriedades biofísias dos modelos. Dados de reologia mostraram que nosso modelo, composto por componentes da matriz extracelular fisiologicamente relevantes, ou seja, colágeno tipo I e fibrinogênio, foi capaz de imitar as propriedades biofísicas de um fígado fibroso, cirrítmico e HCC28,29,30,31,32. Recapitular a rigidez hepática em modelos 3D para HCC é de considerável importância e muitas vezes é negligenciado durante o desenvolvimento do modelo. O aumento da rigidez hepática está relacionado à resistência quimioterápica, à proliferação, migração e dormência no HCC38. Enquanto a ativação de células estelares hepáticas no HCC está associada ao aumento da rigidez da matriz extracelular, com várias vias de sinalização associadas a essas células estelares hepáticas mostrando mecanosensibilidade39.
A inclusão de células associadas ao estroma, como células estelares hepáticas e células endoteliais no desenvolvimento de modelos 3D para HCC, tornou-se cada vez mais relevante. Estudos mostram que esferoides multicelulares compostos por células estelares hepáticas e HCC resultaram em aumento da resistência quimioterápica e migração invasiva, ao mesmo tempo em que imitavam a aparência do tumor HCC in vivo, quando comparados a um modelo de camundongos PXT e amostras de tecido HCC humano17. Estudo semelhante de Jung et al., 2017 encontrou esferoide multicelular composto por células de carcinoma hepatocelular (Huh-7) e endotelial (HUVEC) promovida vascularização e agressividade22. Estes esferoides mostraram viabilidade em concentrações significativamente maiores de doxorubicina e sorafenib quando comparados com esferoides monocultura Huh-722. A avaliação da viabilidade e resposta do nosso modelo à doxorubicina, com valores de rigidez correspondentes ao de HCC e a inclusão de células associadas ao stroma (LX2 e HUVEC), mostrou uma diminuição semelhante em resposta à quimioterapia quando comparada a um modelo de cocultura 2D.  Assim, imitando efetivamente a resistência medicamentosa tipicamente observada em pacientes e outros modelos 3D HCC.
Por se trata de um sistema modular, o modelo pode ser fortificado pela adição de outros componentes da matriz extracelular, ou seja, laminina e ácido hialurônico. Alternativamente, os hidrogéis atuais utilizados neste modelo podem ser substituídos por hidrogéis sintéticos, como alginato de sódio ou quitosan. Outras modificações no modelo atual podem ser a substituição das linhas celulares por culturas celulares primárias para produzir um modelo ainda mais fisiologicamente relevante ou usando combinações de outras linhas tumorais e células estromicas.
Desenvolvemos com sucesso um modelo 3D com propriedades biofísias tunable para estudar interações tumorais-estroma no HCC.  Descobrimos que nosso modelo é mais representativo da situação in vivo quando comparado com as culturas 2D tradicionais em resposta à doxorubicina. No entanto, ainda há muito a ser feito, esperamos caracterizar extensivamente esse modelo e explorar o modelo como uma possível plataforma metastática para responder a questões mais complexas e urgentes que permanecem no estudo HCC.

O carcinoma hepatocelular (HCC) compreende 90% de todos os cânceres hepáticos primários1,2. Com 810.000 mortes e 854.000 novos casos relatados anualmente, ele é atualmente classificado como o quinto câncer mais comum em todo o mundo com uma das maiores incidências de mortalidade1. O desenvolvimento do CCS é predominantemente atribuído à inflamação associada a doenças hepáticas crônicas, ou seja, hepatite viral, ingestão crônica excessiva de álcool, síndrome metabólica, obesidade e diabetes1,3,4.  A inflamação associada a essas condições patológicas resulta em lesão hepatocitária e secreção de várias citocinas que ativam e recrutam células estelares hepáticas e células inflamatórias para iniciar a fibrose5. As células estelares hepáticas são conhecidas por seu papel fundamental na iniciação, progressão e regressão da fibrose hepática. Após a ativação, eles se diferenciam em myofibroblast como células com propriedades contractile, pró-inflamatórias e pró-fibrinogênicas6,7,8. A fibrose resultante, por sua vez, provoca a desregulação da atividade enzimante de remodelação da matriz extracelular, criando um ambiente caracterizado por um aumento geral da rigidez acompanhado da secreção de fatores de crescimento, o que contribui ainda mais para a patogênese HCC9,10. É este ciclo de feedback patogênico contínuo entre hepócitos e o ambiente estroma, que alimenta a iniciação do câncer, a epitelial às transições mesenquimais (EMT), a angiogênese, o potencial metastático e a resposta alterada da droga11,12,13.  A percepção da hepatocarcinogênese em termos da interação entre o tumor e o microambique tumoral é, portanto, de considerável importância não apenas de uma perspectiva mecanicista, mas também de uma perspectiva de tratamento.
Modelos bidimensionais (2D) de cultura celular in vitro são predominantemente usados por 80% dos biólogos de célulascancerosas 14. No entanto, esses modelos não são representativos do verdadeiro microambi ambiente tumoral, que afeta as respostas quimioterápicas14,15,16. Atualmente, 96% dos medicamentos quimioterápicos falham durante os ensaios clínicos14.  Essa alta incidência nas taxas de atrito de medicamentos pode ser atribuída ao fato de que os modelos de pré-triagem in vitro disponíveis não representam totalmente nossa visão atual e compreensão da complexidade do HCC e do microambiente16. Por outro lado, os modelos animais in vivo apresentam sistemas imunológicos comprometidos e discrepâncias nas interações entre o tumor e o microambiente quando comparados aos humanos16,17. Em média, apenas 8% dos resultados obtidos a partir de estudos em animais podem ser traduzidos de forma confiável do pré-clínico para o quadro clínico16,17. Portanto, fica claro que a avaliação do CCH requer o desenvolvimento de uma plataforma in vitro que recapitula efetivamente a complexidade não só do tumor, mas também do microambiente. As plataformas complementariam os modelos de triagem pré-clínica in vitro atualmente disponíveis e reduziriam a quantidade de estudos em animais no futuro7,14.
Uma dessas plataformas são modelos avançados de cultura celular tridimensional (3D). Uma infinidade desses modelos 3D avançados para estudar o HCC surgiram na última década e várias revisões foram publicadas. Os modelos 3D disponíveis para estudar HCC incluem esferoides multicelulares, organoides, modelos à base de andaimes, hidrogéis, microfluidos e bioimvistos. Destes, os esferoides multicelulares são um dos modelos mais conhecidos utilizados no estudo do desenvolvimento de tumores. Os spheroids são um modelo barato e com baixa dificuldade técnica e, ao mesmo tempo, imitam efetivamente a arquitetura do tumor in vivo18,19,20. Eferóides multicelulares contribuíram para uma riqueza de informações sobre hcc17,21,22. No entanto, o tempo de cultura padronizado é carente, pois os esferoides multicelulares são mantidos na cultura entre 7 e 48 dias. O aumento do tempo de cultura é de considerável importância. Eilenberger descobriu que as diferenças na idade esferoide influenciam profundamente o Sorafenib (inibidor de quinase usado para o tratamento de cânceres de fígado) difusividade e toxicidade23. Enquanto Wrzesinski e Fey descobriram que os spheróides hepatocitos 3D requerem 18 dias para restabelecer as principais funções fisiológicas do fígado após a tentação e continuam a exibir a funcionalidade estável por até 24 dias após estarecuperação 24,25.
Alguns dos modelos 3D HCC mais avançados incluem o uso de andaimes de fígado descelularizados humanos e andaimes bio-impressos. Mazza e colegas criaram um andaime 3D natural para modelagem HCC usando fígados humanos descelularizados inadequados para transplante26. Estes andaimes naturais poderiam ser repovoados com sucesso por 21 dias com uma co-cultura de células hepáticas estelares e hepatoblastoma, mantendo a expressão de componentes da matriz extracelular chave, como colágeno tipo I, III, IV e fibronectina. Além da modelagem da doença, este modelo também oferece a vantagem do transplante funcional de órgãos e do rastreamento pré-clínico de medicamentos e toxicidade26. Com os avanços na bioimprimem 3D, andaimes de matriz extracelular 3D agora também podem ser bio-impressos.  Ma e colegas, andaimes de matriz extracelular bio-impresso com propriedades mecânicas variáveis e microarquitetura biomimética utilizando engenheiro de hidrogéis da matriz extracelular27descelularizada . Sem dúvida, todos estes são excelentes modelos 3D HCC. No entanto, a indisponibilidade dos fígados humanos e o custo envolvido na aquisição dos equipamentos e materiais necessários colocam esses modelos em desvantagem. Além disso, esses métodos são tecnicamente avançados, exigindo treinamento extensivo que pode não estar prontamente disponível para todos os pesquisadores.
Com base na complexidade do HCC e atualmente disponíveis modelos 3D, nos esforçamos para desenvolver um modelo 3D HCC abrangente. Buscamos um modelo capaz de recapitular tanto o microambiente pré-maligno quanto o tumor, incorporando valores de rigidez hidrogel ajustáveis.  Além disso, incluímos também linhas celulares associadas ao hepatocelular e estroma, que desempenham um papel fundamental na patogênese do HCC. Estes incluem células endoteliais, células estelares hepáticas e hepatócitos malignos, cultivados em um microambiente composto por hidrogéis fisiologicamente relevantes. Com os hidrogéis escolhidos, colágeno tipo I e fibrinogênio, incorporados em proporções comparáveis às alterações biofísias vistas na rigidez hepática durante a iniciação e progressão do HCC.  Além disso, buscamos um modelo que pudesse ser mantido na cultura por um período prolongado. Vislumbramos um modelo modular e econômico que pode ser configurado com equipamentos básicos, treinamento mínimo e experiência e materiais prontamente disponíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlamarBlue (Resazurin sodium salt)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">211-500</td>
			<td style="width:167px;">Prepare according to manufacturesr recommendations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;), Stabilized</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aprotinin Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78432</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016-2.5KG</td>
			<td style="width:167px;">Anhydrous, granular, &#8804;7.0 mm, &#8805;93.0%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Kebo Biomed Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning Black, clear flat bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS3904-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Corning HTS Transwell-24 well permeable supports</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>CLS3396-2EA</td>
			<td style="width:167px;">HTS Transwell-24 units w/ 0.4 &#956;m pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Discovery Hybrid Rheometer 2</td>
			<td style="width:71px;">TA instruments, Sollentuna, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61965059</td>
			<td>Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Applications, Inc</td>
			<td style="width:119px;">211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A3160902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibrinogen type I-S from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F8630-10G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FLUOstar Omega plate reader</td>
			<td style="width:71px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9394-500ML</td>
			<td>Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Labogene scanspeed 416 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Labogene, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:71px;">Kebo Biomed Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mettler Toledo AG245 Analytical Balance</td>
			<td style="width:71px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon TMS Light microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417-100TAB</td>
			<td style="width:167px;">Prepare according to manufacturers recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL</td>
			<td style="width:71px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">50201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653-1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B619298</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC20 Automated cell counter</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TC20 cell counter counting slides</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9549</td>
			<td style="width:167px;">Powder, suitable for cell culture, &#8805;1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trypsin (2.5%) 10x</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1x in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6414-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Solution, sterile-filtered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a biomimetic model for liver cancer to study tumor-stroma interactions in a 3d environment with tunable bio-physical properties

Carcinoma hepatocelular (HCC) é um tumor hepático primário que se desenvolve na esteira de uma doença hepática crônica. Doença hepática crônica e inflamação leva a um ambiente fibroso apoiando e conduzindo hepatocarcinogênese. A percepção sobre hepatocarcinogênese em termos da interação entre o microambique do tumor e as células tumorais é, portanto, de considerável importância. Modelos tridimensionais (3D) de cultura celular são propostos como o elo perdido entre os modelos atuais in vitro de cultura celular 2D e modelos in vivo animal. Nosso objetivo era projetar um novo modelo HCC biomimético 3D com compartimento estromático e vasculatura fibrosa. Hidrogéis fisiologicamente relevantes, como colágeno e fibrinogênio, foram incorporados para imitar as propriedades biofísicas do tumor ECM. Neste modelo, as células LX2 e HepG2 embutidas em uma matriz de hidrogel foram semeadas na inserção transmembrana invertida. As células HUVEC foram então semeadas no lado oposto da membrana. Três formulações constituídas por hidrogéis ECM incorporados com células foram preparadas e as propriedades biofísias foram determinadas pela reologia. A viabilidade celular foi determinada por um ensaio de viabilidade celular ao longo de 21 dias. O efeito da droga quimioterápica daxorubicina foi avaliado tanto na cocultura 2D quanto no nosso modelo 3D por um período de 72h. Os resultados da reologia mostram que as propriedades biofísicas de um fígado fibroso, cirrítmico e HCC podem ser imitadas com sucesso. No geral, os resultados indicam que este modelo 3D é mais representativo da situação in vivo em comparação com as culturas 2D tradicionais. Nosso modelo de tumor 3D mostrou uma resposta reduzida à quimioterapia, imitando a resistência medicamentosa normalmente vista em pacientes com HCC.

Faixas de concentração e volume de semeadura A otimização do protocolo para obtenção do protocolo de funcionamento final ocorreu de acordo com o diagrama esquemático apresentado na Figura 3. Dois hidrogéis fisiologicamente relevantes, Colágeno tipo I e Fibrinogen, foram identificados por meio de pesquisa bibliologia35,36.  Começando com o colágeno de cauda de rato tipo I, uma gama de concentrações (4, 3, 2 e 1 mg/mL) foi semeada em inserções invertidas para determinar sua capacidade de aderir com sucesso à inserção uma vez invertida novamente. Todas as concentrações dentro desta faixa foram capazes de formar géis, porém os géis de colágeno pareciam achatados e tinham várias bolhas de ar presas dentro deles por causa do manuseio e pipetação, ver Figura 4 e Figura 5. Para determinar o volume ideal de semeadura para melhorar a qualidade do gel de colágeno, uma gama de volumes de semeadura (100, 150 e 200 μL), foi semeada em pastilhas invertidas, ver Figura 5.  O volume de semeadura não teve influência no aparecimento do gel ou na presença de bolhas dentro do gel. Assim, decidiu-se que 200 μL era o volume de semeadura ideal produzindo os géis mais completos. A fibrinogen também foi avaliada por sua capacidade de produzir um gel que pudesse aderir a uma inserção por um período prolongado.  Foi preparada e semeada uma faixa de concentração (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/mL) e semeada a um volume de 200 μL na tampa de uma placa de 12 poços, ver Figura 6. Dentro de 20 min após semeadura todas as concentrações foram capazes de formar com sucesso um gel. No entanto, as concentrações 5 e 1 mg/mL foram excluídas, pois os géis formados tinham uma consistência fluida e começaram a se desprender da tampa após serem mantidos durante a noite a 37 °C.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig3.jpg"> Figura 3: Diagrama esquemático de otimização do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig4.jpg"> Figura 4: Géis de colágeno 4 mg/mL contendo 1,0 x 105 células/mL semeadas em pastilhas mostrando bolhas presentes no gel. A inserção à esquerda foi desgaseada no gelo por 15 minutos, enquanto a inserção à direita não foi desgaseada. A desgaseamento não teve qualquer efeito sobre as bolhas presentes nos géis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig5.jpg"> Figura 5: Géis de colágeno 4 mg/mL contendo 1,0 x 105 células/mL semeadas em pastilhas em volumes variados. (A) Insira no esquerdo 100 μL, médio 150 μL e direito 200 μL, logo após a semeadura. Bolhas nos géis ainda estavam presentes. (B) Insira no 200 μL esquerdo, médio 150 μL e direito 100 μL, após 60 min crosslinking. Todos os géis, independentemente do volume, ainda parecem planos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig6.jpg"> Figura 6: Fibrinogen (200 μL) em uma faixa de concentração de 70 a 1 mg/mL semeada na tampa de uma placa de 12 poços. (A) Géis logo após a semeadura. (B) Géis 20 min após a semeadura. (C)Géis mantidos durante a noite. Todos os géis parecem bem arredondados, os géis de 5 mg/mL e 1 mg/mL foram excluídos, pois pareciam ter uma consistência mais fluida 20 min após a semeadura e começaram a se desprender da tampa depois de serem mantidos durante a noite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Colágeno e fibrinogênio de combinação Com base nos resultados da concentração de colágeno e fibrinogênio, foi avaliado o efeito da combinação do colágeno e fibrinogênio. Três pastilhas foram configuradas com o seguinte, colágeno de 4 mg/mL, fibrinogen de 20 mg/mL e uma ração 1:1 de colágeno (4 mg/mL) e fibrinogen (20 mg/mL), ver Figura 7. Logo após a semeadura dos hidrogéis, observamos que a inserção apenas com colágeno ainda tinha uma aparência plana combinada com a ocorrência de bolhas dentro do gel. As pastilhas com fibrinogênio produziram um gel completo e arredondado, assim como a inserção com a combinação de colágeno e fibrinogênio. Após a ligação cruzada a 37 °C por 60 min, todos os géis se fixaram na pastilha e permaneceram anexados após a incubação durante a noite a 37 °C.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig7.jpg"> Figura 7: Efeito da combinação de colágeno e fibrinogênio. (A) Colágeno 4 mg/mL semeado na inserção à esquerda, fibrinogen 20 mg/mL semeado na inserção no meio e colágeno 4 mg/mL, fibrinógeno 20 mg/mL (1:1 ração) semeado na inserção à direita. Todos os géis semeados em um volume de 200 μL contendo 1,0 x 105 células/mL, todos os géis foram cruzados por 60 min a 37 °C.(B) Colágeno 4 mg/mL 60 min após crosslinking, gel parecia plano e tinha bolhas. (C) Insira no fibrinênio esquerdo 20 mg/mL, o gel apareça arredondado, sem bolhas presentes, insira no colágeno direito 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel, gel é bem arredondado sem bolhas. (D) Gel de colágeno 4 mg/mL depois de ser mantido durante a noite a 37 °C, o gel ainda continha uma grande quantidade de bolhas, algum inchaço do gel ocorreu. (E) Fibrinogen 20 mg/mL mantido durante a noite a 37 °C. (F) Colágeno 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel mantido durante a noite a 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig7large.jpg" target="_blank">desta figura.</a>
Determinando a densidade de semeadura celular Com base na experiência anterior de trabalhar com hidrogéis, foi configurado um experimento para determinar a densidade ideal de semeadura celular (dados não mostrados)37. As células foram incorporadas em uma combinação de colágeno e fibrinogênio na seguinte faixa de concentração (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1.0 x 106, 1,5 x 106 e 2,0 x 106 células/mL), 2,0 x 106 células/mL foi encontrada como a densidade ideal de semeadura.
Reologia Dez formulações das combinações de hidrogel fibrinogênio e colágeno foram avaliadas por meio de reologia, ver Tabela 2. O objetivo era determinar qual dessas formulações poderia imitar a rigidez hepática vista durante o desenvolvimento do HCC. A literatura forneceu valores conhecidos de rigidez hepática para ratos, camundongos e seres humanos durante a fibrose, cirrose e HCC e o objetivo era chegar o mais próximo possível desses valores28,29,30,31,32. As dez formulações estabelecidas na Tabela 2 foram preparadas em triplicado e o módulo de armazenamento de cada um foi determinado por meio de um reômetro, resultados mostrados na Figura 8.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulação</td>
			<td>Fibrinogênio (mg/ml)</td>
			<td>Colágeno (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Combinações de colágeno e fibrinogênio em várias concentrações avaliadas com Reologia para determinar valores de rigidez
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig8.jpg"> Figura 8: Valores de rigidez de hidrogel para combinações de colágeno e fibrinogênio em várias concentrações avaliadas com Reologia. O módulo de armazenamento e o módulo de perda foram determinados a 37 °C e 1Hz por meio de um Reômetro Híbrido Discovery HR-2 (n = 3, Barras de Erro = SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Dessas dez fórmulas, três foram escolhidas para prosseguir. Estes incluíram 2 mg/mL colágeno tipo I e fibrinogen de 10 mg/mL correspondentes aos valores de rigidez hepática no início da fibrose, 2 mg/mL de colágeno tipo I e fibrinogen de 30 mg/mL correspondente à cirrose e 2 mg/mL de colágeno tipo I e 40 mg/mL fibrinogen correspondente ao HCC, ver Figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig9.jpg"> Figura 9: Valores de rigidez de hidrogel para várias formulações de hidrogel fibrinogênio/colágeno escolhidos para continuar.  O módulo de armazenamento e o módulo de perda foram determinados a 37 °C e 1 Hz (n = 3, barras de erro = SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Viabilidade, resposta a medicamentos e potencial metastático Os resultados do ensaio alamarblue mostraram uma viabilidade celular global reduzida dentro da cocultura 2D, menor do que o esperado com base nos valores conhecidos relatados ic 25, 50 e 75, quando comparado com o controle não tratado, ver Figura 10. Isso pode ser atribuído às células LX2 em nossa co-cultura que são mais sensíveis ao tratamento da Doxorubicina. No entanto, em nosso modelo 3D notamos e aumentamos a resistência à doxorubicina, confirmando a diminuição do potencial quimioterápico frequentemente visto em sistemas de modelos 3D. A significância estatística em relação aos controles foi avaliada utilizando-se o teste T Estudantil (duas caudas), com P<0,05 considerado significativo.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig10.jpg"> Figura 10: Viabilidade celular percentual de um modelo de cocultura 2D em comparação com o modelo 3D após o tratamento com Doxorubicina em várias concentrações por um período de 72h. Os resultados normalizados em relação ao controle não tratado (n=3, barras de erro = SD) (* = p<0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os construtos de gel foram inspecionados visualmente diariamente usando um microscópio de luz para acompanhar o crescimento celular dentro de diferentes concentrações dos hidrogéis. As células encheram os hidrogéis de forma homogênea e compacta, a partir do dia 7 os esferoides começaram a se reunir dentro da matriz.

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A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

a-biomimetic-model-for-liver-cancer-to-study-tumor-stroma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.1K visualizações.  Uppsala University. Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

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Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Pesquisa do câncer

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Development and Angiographic Use of the Rabbit VX2 Model for Liver Cancer

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of Interventional Radiology. This model employs an anaplastic squamous cell carcinoma that is easily and reliably propagated in the skeletal muscle of donor rabbits for eventual harvest and allograft implantation into the liver of na&#239;ve recipients. This tumor graft rapidly grows within the liver of recipient rabbits into an angiographically identifiable tumor characterized by a necrotic core surrounded by a viable hypervascular capsule. The physical size of the rabbit anatomy is sufficient to facilitate vascular instrumentation allowing for the application and testing of various interventional techniques. Despite these benefits, there exists a paucity of technical resources to act as a concrete reference for researchers working with the model. Herein, we present a comprehensive visual outline for the technical aspects of development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 tumor model for use by novice and experienced researchers alike.

The goal of this article is to provide a primer for the development and use of the VX2 carcinoma rabbit model for liver cancer.

Desenvolvimento e uso angiográfico do modelo VX2 coelho para câncer de fígado

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, depending on the cancer type. To reduce the brain metastatic tumor burden, gaps in basic and translational knowledge need to be addressed. Major challenges include a paucity of reproducible preclinical models and associated tools. Three-dimensional models of brain metastasis can yield the relevant molecular and phenotypic data used to address these needs when combined with dedicated analysis tools. Moreover, compared to murine models, organ-on-a-chip models of patient tumor cells traversing the blood brain barrier into the brain microenvironment generate results rapidly and are more interpretable with quantitative methods, thus amenable to high throughput testing. Here we describe and demonstrate the use of a novel 3D microfluidic blood brain niche (&#181;mBBN) platform where multiple elements of the niche can be cultured for an extended period (several days), fluorescently imaged by confocal microscopy, and the images reconstructed using an innovative confocal tomography technique; all aimed to understand the development of micro-metastasis and changes to the tumor micro-environment (TME) in a repeatable and quantitative manner. We demonstrate how to fabricate, seed, image, and analyze the cancer cells and TME cellular and humoral components, using this platform. Moreover, we show how artificial intelligence (AI) is used to identify the intrinsic phenotypic differences of cancer cells that are capable of transit through a model &#181;mBBN and to assign them an objective index of brain metastatic potential. The data sets generated by this method can be used to answer basic and translational questions about metastasis, the efficacy of therapeutic strategies, and the role of the TME in both.

Here, we present a protocol for preparing and culturing a blood brain barrier metastatic tumor micro-environment and then quantifying its state using confocal imaging and artificial intelligence (machine learning).