Questa ricerca è stata finanziata attraverso sovvenzioni ottenute dalla Fondazione svedese per il cancro (Cancerfonden, CAN2017/518), dalla società svedese per la ricerca medica (SSMF, S17-0092), dalla fondazione O.E. och Edla Johanssons e dalla fondazione Olga Jönssons.  Queste fonti di finanziamento non sono state coinvolte nella progettazione dello studio; raccolta, analisi e interpretazione dei dati; redazione della relazione; e nella decisione di sottoporre l'articolo alla pubblicazione. La stampa 3D di distanziali progettati su misura utilizzati in questo protocollo è stata eseguita presso la struttura di stampa 3D dell'Università di Uppsala presso il Settore Disciplinare di Medicina e Farmacia, U-PRINT@mcb.uu.se. Ringraziamo Paul O'Callaghan per il prezioso contributo dato al nostro progetto.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig1.jpg"> Figura 1: Rappresentazioni grafiche della creazione del modello HCC biomimetico 3D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.</a>
NOTA: Il flusso di lavoro complessivo di questo protocollo è stabilito nelle illustrazioni della figura 1
1. Preparazione della soluzione di stock di fibrinogeno
<ol><li>Preparare una soluzione stock di cloruro di calcio da 1 M (CaCl2),pesando 2,21 g cacl2 e aggiungendola all'acqua distillata da 20 mL (dH2O). La soluzione stock può essere conservata a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di aprotinina da 20 mL (1218,75 KIU/mL) pesando 5 mg di aprotinina e aggiungendola alla soluzione stock di20mL dH 2 O. Aliquot in aliquote da 1 mL e conservare a -20 °C.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 10 mL di 80 mg/mL di soluzione di fibrinogeno.<ol>
<li>In un tubo da 50 ml aggiungere 7.849 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 2,051 mL di aprotinina (1218,75 KIU/mL) per una concentrazione finale di aprotinina di 250 KIU/mL e 100 μL CaCl2 (1M) per una concentrazione finale di CaCl2 di 10 mM.</li>
		<li>Pesare 800 mg di fibrinogeno.</li>
		<li>Pesare 200 mg di cloruro di sodio (NaCl) affinché la soluzione stock contenga il 2% con NaCl.</li>
		<li>Aggiungere il fibrinogeno e il NaCl in incrementi al tubo da 50 mL contenente pbs, aprotinina e CaCl2. Non mescolare o agitare vigorosamente in quanto ciò si tradurrà in gelifici fibrinogeni e grumi che si formano nella soluzione.</li>
		<li>Posizionare il tubo da 50 ml della soluzione di calcio fibrinogeno orizzontalmente su uno shaker e agitare a un ambiente basso di 300 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta che la soluzione si è sciolta, filtrarla utilizzando un filtro siringa da 0,22 μm o un filtro superiore della bottiglia a seconda del volume. È importante sottolineare che non autoclavare la soluzione di fibrinogeno in quanto ciò distruggerà il fibrinogeno. NOTA: Questa parte del protocollo può richiedere da 2 a 5 ore a seconda della quantità di soluzione stock, questo tempo dovrebbe essere preso in considerazione durante la configurazione sperimentale.</li>
</ol>2. Inserti di rivestimento con collagene prima di seminare gli idrogel sugli inserti
<ol><li>In una cappa di flusso laminare o in un cappuccio di coltura tissutale, utilizzando pinzette sterilizzate, rimuovere gli inserti dalla piastra e posizionarlo invertito sul coperchio della piastra.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 100 mL di 20 mM di acido acetico glaciale aggiungendo 115 μL di acido acetico glaciale a 25 ml di dH 2 O eregolaread un volume finale di 100 mL con dH 2 O.Filtrarela soluzione utilizzando un filtro siringa da 0,22 μm. La soluzione stock può essere memorizzata su RT.</li>
	<li>Preparare 2 mL di una soluzione di collagene da 100 μg/mL da una soluzione di collagene da 5 mg/mL aggiungendo 40 μL della soluzione di collagene da 5 mg/mL a 1,960 mL della soluzione di stock di acido acetico glaciale da 20 mM preparata in 2,2.</li>
	<li>Rivestire gli inserti con la soluzione di collagene da 100 μg/mL preparata in 2.3 pipettando 100 μL della soluzione su ogni inserto. Lasciare asciugare l'aria all'interno della cappa a flusso laminare o della cappa di coltura tissutale per 2-3 ore.</li>
	<li>Una volta che gli inserti hanno asciugato lavare ogni inserto 3x con PBS. Aggiungere 1 mL di PBS ad ogni pozzo di una piastra di 12 pozza, posizionare gli inserti con rivestimento di collagene rivolto verso il basso nei pozzi, rimuovere il PBS dal pozzo e ripetere la procedura. Lasciare asciugare l'aria all'interno della cappa di flusso laminare da 1 a 2 ore. ATTENZIONE: L'acido acetico è tossico per le cellule e gli inserti devono essere lavati accuratamente con PBS.</li>
	<li>Aggiungere un distanziale stampato in 3D personalizzato sugli inserti, questo sarà necessario una volta che i gel sono appesi all'inserto per impedire loro di toccare il pozzo inferiore della piastra(Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig2.jpg"> Figura 2: Distanziale stampato in 3D personalizzato <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="7"><li>Coprire gli inserti invertiti con la parte inferiore della piastra e posizionarlo nell'incubatrice fino a quando le cellule non sono incorporate negli idrogel e pronte per essere seminate.</li>
</ol>3. Cellule di semina incorporate in idrogel su inserti
NOTA: La tabella 1 fornisce una descrizione di 3 formulazioni con concentrazioni variabili di fibrinogeno che verranno preparate. La prima formulazione corrisponde al fegato durante l'insorgenza della fibrosi, due cirrosi e tre HCC, i valori di rigidità per ciascuna di queste formulazioni sono stati determinati con reologia durante l'ottimizzazione del protocollo.
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulazione</td>
			<td>Concentrazione finale di fibrinogeni (mg/mL)</td>
			<td>Concentrazione finale di collagene (mg/mL)</td>
			<td>Cellule (coltura LX2 + HepG2 1:1)</td>
			<td>Stadio del fegato</td>
			<td>Valori di rigidità epatica della letteratura (kPa)</td>
			<td>Valore di rigidità del modello di Reologia (kPa)</td>
			<td>Formulazione</td>
			<td>Fibrinogen da aggiungere (mL)</td>
			<td>Collagene da aggiungere (mL)</td>
			<td>10 % DMEM (mL)</td>
			<td>Trombina (μL)</td>
			<td>
Riferimenti</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 celle/mL</td>
			<td>Fibrosi</td>
			<td>≥2</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4</td>
			<td>28; 29; 30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 celle/mL</td>
			<td>Cirrosi</td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>2</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.45</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 celle/mL</td>
			<td>Hcc</td>
			<td>≥10 anni</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1</td>
			<td>28; 31; 32</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Descrizione delle formulazioni per le cellule di semina incorporate negli idrogel sugli inserti
<ol><li>Preparare 1 M di soluzione di idrossido di sodio aggiungendo 3,99 g di NaOH a 100 mL di dH2O.  La soluzione può quindi essere filtrata utilizzando un filtro siringa da 0,22 μm. Conservare la soluzione stock su RT.</li>
	<li>Mettere il collagene da 5 mg/mL e 10 mL di 1 M NaOH sul ghiaccio.</li>
	<li>Preriscaldare 50 mL PBS, 15 mL di tripina, 70 mL 10% DMEM e soluzione di stock di fibrinogeno, preparata nella sezione 1, a 37 °C per 20 minuti in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Preparare le sospensioni cellulari.<ol>
<li>Lavare le cellule stellate epatiche (LX2) e il carcinoma epatico (HepG2) nelle fiasche di coltura T175 due volte con 10 mL di PBS.</li>
		<li>Tripinare le cellule con tripina di 6 mL per 4 min a 37 °C.</li>
		<li>Inattivare la tripina con 6 mL del 10% di DMEM.</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare in tubo da 15 ml e centrifugare per 3 min a 300 x g.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e rimescolare ogni linea cellulare in 5 mL del 10% DMEM.</li>
		<li>Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato: aggiungere 10 μL di ogni sospensione cellulare allo scivolo della camera di conteggio e inserire la diapositiva nel contatore della cella. Il conteggio delle celle viene visualizzato come celle/mL.</li>
		<li>Diluire le celle da ogni linea cellulare a 1 x 106 celle per ml utilizzando il numero di celle nel passaggio 3.4.6 in tubi da 15 ml chiaramente contrassegnati. Centrifugare le diluizioni per 3 min a 300 x g.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e aggiungere il 10% di DMEM a ciascun tubo da 15 ml secondo la tabella 1, i valori forniti nella tabella sono per 2 ml di ciascuna formulazione.</li>
	<li>Neutralizzare la quantità di collagene con 10 μL / mL NaOH (1 M) e aggiungere il collagene neutralizzato alla sospensione cellulare, il 10% di DMEM presente diventerà giallo, una volta che la sospensione viene mescolata accuratamente pipettando con una punta tagliata diventerà un rosa brillante.</li>
	<li>Aggiungere il fibrinogeno alla sospensione delle cellule collagene secondo la tabella 1, utilizzando una punta di pipetta tagliata, mescolare accuratamente la sospensione.</li>
	<li>Infine aggiungere trombina alla sospensione cellulare collagene-fibrinogeno, 0,1 TROMBINA KIU per ogni 10 mg di fibrinogeno.</li>
	<li>Rimuovere dall'incubatore gli inserti rovesciati pre-rivestiti preparati nella sezione 2 e utilizzando una punta di pipetta da 200 μL tagliata, pipetta 200 μL della sospensione preparata sugli inserti designati. Lasciare che i gel si retinino per 15 minuti all'interno della cappa di flusso laminare.</li>
	<li>Dopo 15 minuti, posizionare delicatamente la sezione inferiore della piastra sui gel e spostarli nell'incubatrice per consentire ai gel di scollegare a 37 °C per 45 minuti.</li>
	<li>Una volta che i gel sono stati retillati, invertire nuovamente gli inserti e aggiungere 2 mL di DMEM al 10% a ciascuno dei pozzali inferiori della piastra.</li>
</ol>4. Semina di cellule endoteliali
<ol><li>Preriscaldare 25 mL hanks soluzione salina bilanciata (HBSS), 10 mL tripina, 10 mL inibitore della tripsina e 50 mL mezzo di crescita endoteliale, a 37 °C per 20 minuti in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Preparare la sospensione cellulare endoteliale (HUVEC).<ol>
<li>Lavare le cellule HUVEC nei contenitori di coltura T175 due volte con HBSS da 10 mL.</li>
		<li>Tripinare le cellule con tripina di 6 mL per 4 min a 37 °C. Inattivare la tripsina con inibitore della tripsina da 6 mL. Raccogliere la sospensione cellulare in 15 ml di tubo e centrifuga per 3 min a 200 x g.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione aspirare il supernatante e sospendere le cellule in mezzo di crescita endoteliale da 5 mL.</li>
		<li>Contare le celle come descritto in precedenza nella 3.4.6 utilizzando un contatore di celle automatico.</li>
		<li>Utilizzando il conteggio delle cellule dal contatore cellulare, preparare la densità di semina di 1,0 x10 4 cellule/mL nel mezzo di crescita endoteliale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seme 500 μL della sospensione cellulare HUVEC in ogni pozzo della parte superiore dell'inserto per avere un volume finale di 5,0 x 103 celle per inserto.</li>
</ol>5. Manutenzione
<ol><li>Sostituire il mezzo di crescita ogni secondo giorno, aspirare il mezzo di crescita trascorso sia dal pozzo che dall'inserto. Aggiungere 2 mL 10% DMEM ai pozzi contenenti il gel e 0,5 mL di mezzo di crescita endoteliale agli inserti contenenti le cellule HUVEC.</li>
	<li>Mantenere il modello per 21 giorni prima della sperimentazione.</li>
</ol>6. Reologia
<ol><li>Misurare i moduli di stoccaggio delle formulazioni in gel per indicare i valori di rigidità utilizzando un reometro, eseguendo sweep di frequenza da 0,1 a 20 Hz a 0,267% e 37 °C, con una forza assiale costante di 0,1N utilizzando una geometria in acciaio inossidabile a piastre parallele di 8 mm di diametro.</li>
</ol>7. Vitalità e risposta alla droga
<ol><li>Determinare la risposta e la vitalità del farmaco nelle co-culture 2D e nel modello 3D.<ol>
<li>Seminare cellule HepG2 (5,0 x 103 celle/mL) e LX2 (5,0 x 103 celle/mL) in un rapporto 1:1 per la co-coltura 2D in un fondo nero chiaro di 96 pozzi a una densità di semina di 1,0 x 104 celle/mL.   Consentire alle celle di attaccarsi durante la notte.</li>
		<li>Impostare il modello 3D in modo che corrisponda a un ambiente cirrotico con un valore di rigidità di 6 kPa.  Mantenere il modello per 21 giorni prima del trattamento con doxorubicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Due ore prima del trattamento con doxorubicina, aspirare il mezzo di coltura sia dal modello 2D che 3D. Lavare entrambi i modelli due volte con PBS. Aggiungere il mezzo di fame (DMEM integrato con soluzione antibiotica antimicotica 1% v/v) alla cocoltura 2D (200 μL per pozzo) e al modello 3D (2 mL ai pozzi contenenti l'idrogel e 500 μL all'inserto).</li>
	<li>Somministrare doxorubicina sia al modello 2D che a quello 3D.  I dosaggi sono i seguenti: 0,5, 1 e 1,5 mM corrispondenti rispettivamente ai valori IC25, 50 e 75.  Trattare entrambi i modelli per 72 ore. NOTA: La doxorubicina, un inibitore della topoisomerasi II, è uno dei primi farmaci chemioterapici utilizzati per l'HCC ed è anche uno degli agenti chemioterapici più attivi nel trattamento di HCC33,34.</li>
	<li>Dopo 72 ore, mezzo di coltura aspirato sia dal modello 2D che 3D. Assicurarsi che qualsiasi supporto di coltura rimanente venga rimosso lavando entrambi i modelli due volte con PBS.</li>
	<li>Preparare AlamarBlue secondo le raccomandazioni del produttore e aggiungere ai pozzi del modello 2D e 3D. Aggiungere 150 μL per pozzo per la coltura 2D e 2 mL per pozzo e 500 μL per inserto per coltura 3D.  Incubato durante la notte a 37°C.</li>
	<li>Dopo il trasferimento dell'incubazione 150 μL dell'AlamarBlue da ogni pozzo della configurazione 3D in una piastra nera chiara a 96 pondo. AlamarBlue può essere letto direttamente dalla piastra per il modello 2D.</li>
	<li>Leggi la fluorescenza con un lettore di micropiatta a lunghezza d'onda di eccitazione e lunghezza d'onda di emissione di 485 e 550 nm, rispettivamente.</li>
	<li>Calcolare la vitalità percentuale delle celle in entrambi i modelli utilizzando la formula seguente: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61606/61606eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).</li><li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+spheroids+exhibit+stable+physiological+functionality+for+at+least+24+days+after+recovering+from+trypsinisation.">Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation.</a> Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+of+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+3D+bioprinting+of+decellularized+extracellular+matrix+with+regionally+varied+mechanical+properties+and+biomimetic+microarchitecture.">Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture.</a> Biomaterials. 185, 310-321 (2018).</li><li>Mueller, S., Sandrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stiffness:+a+novel+parameter+for+the+diagnosis+of+liver+disease.">Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease.</a> Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).</li><li>Wang, M. 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Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful.</a> Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stiffness+is+associated+with+risk+of+decompensation,+liver+cancer,+and+death+in+patients+with+chronic+liver+diseases:+A+systematic+review.">Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).</li><li>Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. 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R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+for+hepatocellular+carcinoma:+the+present+and+the+future.">Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future.</a> World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).</li><li>Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cues+guiding+matrix+stiffness+in+liver+fibrosis.">Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis.</a> BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).</li><li>Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un metodo per creare un modello biomimetico per HCC. È stato stabilito un flusso di lavoro chiaro e sono stati identificati i passaggi critici coinvolti. Questi passaggi critici includono, preparazione della soluzione di stock di fibrinogeno, rivestimento degli inserti con collagene e semina delle cellule imbecilli nell'idrogel. Durante la preparazione della soluzione di stock di fibrinogeno è importante aggiungere il fibrinogeno in incrementi più piccoli a concentrazioni più elevate. Ciò non solo ridurrà il tempo necessario allo scioglimento del fibrinogeno, ma impedirà anche al fibrinogeno di gelare in modo incoerente e prematuro, come si vede nella figura 11. La preparazione del gel fibrinogeno richiede una notevole quantità di tempo e questo può influenzare il successo sperimentale complessivo. I risultati indicano che una volta che il gel fibrinogeno inizia a gelare in modo incoerente è meglio scartarlo. Gli inserti devono essere rivestiti con collagene, lavati con PBS e asciugati all'interno della cappa di flusso laminare prima di seminare le cellule incorporate negli idrogel. Il mancato rispetto dell'asciutto degli inserti comporterà la fuoriuscita degli idrogel sui bordi dell'inserto, con conseguente gel irregolare. Le irregolarità del gel influenzeranno in ultima analisi i risultati in cui la diffusione è un fattore.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig11.jpg"> Figura 11: Preparazione del gel fibrinogeno per formulazioni di fibrinogeno/idrogel di collagene. (A) Soluzione di gel fibrinogeno che ha formato grumi e ha iniziato a gelare prematuramente con fibrinogeno non disciolto che aderisce al tubo. (B)Soluzione di gel fibrinogeno che si è completamente sciolta, la soluzione è chiara e leggermente più viscosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Si consiglia di lavorare il più velocemente possibile durante la semina della sospensione della cellula idrogel sugli inserti, poiché il componente fibrinogeno inizierà a incrociarsi con l'aggiunta di trombina.  Preparare volumi di lavoro più piccoli alla volta quando si lavora con sospensioni in gel a concentrazioni più elevate per evitare che il gel si retichi durante la semina. Quest'ultimo avrà un effetto sulla distribuzione e sulla quantità di gel seminato su ogni pozzo. L'ordine di aggiunta dei componenti è fondamentale, in questo protocollo abbiamo fornito un flusso di lavoro semplificato per evitare che i gel si retinino prematuramente.  A causa della viscosità delle sospensioni in gel idrogel che lavorano con una punta di pipetta tagliata si consiglia durante la miscelazione e la misurazione.  Quando si mescola la sospensione assicurarsi che ciò avvenga in modo rapido e uniforme per creare una sospensione omogenea. La miscelazione irregolare si tradurrà in un gel eterogeneo che influenzerà negativamente i risultati, vedere figura 12.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig12.jpg"> Figura 12: Gel di collagene/fibrinogeno seminati su 12 piastre di pozzo. Tutti i gel seminati ad un volume di 200 μL contenente 2 mg/mL collagene e 20 mg/mL fibrinogeno con 2,0 x 106 cellule/mL. (A) Gel idrogel con consistenza eterogenea, distribuzione irregolare visibile degli idrogel. (B)Idrogel miscelati in modo omogeneo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig12large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A seguito dell'ottimizzazione del protocollo, il modello è stato valutato per determinare le proprietà bio-fisiche dei modelli. I dati reologico hanno dimostrato che il nostro modello, composto da componenti della matrice extracellulare fisiologicamente rilevanti vale a dire collagene di tipo I e fibrinogeno, è stato in grado di imitare le proprietà bio-fisiche di un fegato fibrotico, cirrotico e HCC28,29,30,31,32. Ricapitolare la rigidità epatica nei modelli 3D per HCC è di notevole importanza e viene spesso trascurato durante lo sviluppo del modello. L'aumento della rigidità epatica è correlato alla resistenza chemioteraptica, alla proliferazione, alla migrazione e alla dormienza all'interno dell'HCC38. Mentre l'attivazione di cellule stellate epatiche in HCC è associata ad una maggiore rigidità della matrice extracellulare, con diverse vie di segnalazione associate a queste cellule stellate epatiche che mostrano meccanosensibilità39.
L'inclusione di cellule associate allo stroma come cellule stellate epatiche e cellule endoteliali nello sviluppo di modelli 3D per HCC è diventata sempre più rilevante. Gli studi dimostrano che gli sferoidi multicellulari composti da stellete epatiche e cellule HCC hanno portato a una maggiore resistenza chemioterapica e migrazione invasiva, mentre imitano l'aspetto tumorale HCC in vivo, rispetto a un modello di topi PXT e campioni di tessuto HCCumano 17. Uno studio simile di Jung et al., 2017 ha trovato sferoide multicellulare costituito da carcinoma epatocellulare (Huh-7) e cellule endoteliali (HUVEC) ha promosso vascolarizzazione e aggressività22. Questi sferoidi mostravano vitalità a concentrazioni significativamente più elevate di doxorubicina e sorafenib rispetto agli sferoidi monocoltura Huh-722. La valutazione della fattibilità e della risposta del nostro modello alla doxorubicina, con valori di rigidità corrispondenti a quello di HCC e l'inclusione di cellule associate allo stroma (LX2 e HUVEC), ha mostrato una diminuzione simile in risposta alla chemioterapica rispetto a un modello di co-coltura 2D.  Pertanto, imitando efficacemente la resistenza ai farmaci tipicamente osservata nei pazienti e in altri modelli HCC 3D.
Poiché si tratta di un sistema modulare, il modello può essere fortificato con l'aggiunta di altri componenti della matrice extracellulare, vale a dire la laminina e acido ialuronico. In alternativa, gli idrogel attuali utilizzati all'interno di questo modello possono essere sostituiti da idrogel sintetici come alginato di sodio o chitosano. Ulteriori modifiche al modello attuale possono essere la sostituzione delle linee cellulari con colture cellulari primarie per produrre un modello ancora più fisiologicamente rilevante o utilizzando combinazioni di altre linee tumorali e cellulari stromali.
Abbiamo quindi sviluppato con successo un modello 3D con proprietà bio-fisiche tonnibili per lo studio delle interazioni tumore-stroma in HCC.  Abbiamo trovato il nostro modello più rappresentativo della situazione in vivo rispetto alle culture 2D tradizionali in risposta alla doxorubicina. Tuttavia, c'è ancora molto da fare, speriamo di caratterizzare ampiamente questo modello ed esplorare il modello come una possibile piattaforma metastatica per rispondere a domande più complesse e pressanti che rimangono nello studio HCC.

Il carcinoma epatocellulare (HCC) comprende il 90% di tutti i tumori primari delfegato 1,2. Con 810.000 decessi e 854.000 nuovi casi segnalati ogni anno, è attualmente classificato come il quinto cancro più comune al mondo con una delle più alte incidenze di mortalità1. Lo sviluppo dell'HCC è principalmente attribuito all'infiammazione associata a malattie croniche del fegato, vale a dire epatite virale, assunzione cronica eccessiva di alcol, sindrome metabolica, obesità e diabete1,3,4.  L'infiammazione associata a queste condizioni patologiche si traduce in lesioni da epatociti e secrezione di varie citochine che attivano e reclutano cellule stellate epatiche e cellule infiammatorie per avviare la fibrosi5. Le cellule stellate epatiche sono note per il loro ruolo chiave nell'iniziazione, nella progressione e nella regressione della fibrosi epatica. Al momento dell'attivazione si differenziano in miofibroblasti come cellule con proprietà contrattili, pro-infiammatorie e pro-fibrinogene6,7,8. La fibrosi risultante a sua volta causa la disregolazione dell'attività enzimatica di rimodellamento della matrice extracellulare, creando un ambiente caratterizzato da una maggiore rigidità complessiva accompagnata dalla secrezione di fattori di crescita, che contribuisce ulteriormente alla patogenesi HCC9,10. È questo ciclo di feedback patogeno continuo tra epatociti e ambiente stromale, che alimenta l'iniziazione del cancro, le transizioni epiteliali a mesenchimali (EMT), l'angiogenesi, il potenziale metastatico e la risposta alteratadel farmaco 11,12,13.  La comprensione dell'epatocarcinogenesi in termini di interazione tra il tumore e il micro-ambiente tumorale è, quindi, di notevole importanza non solo dal punto di vista meccanicistico ma anche dal punto di vista del trattamento.
I modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) in vitro sono utilizzati prevalentemente dall'80% dei biologi delle celluletumorali 14. Tuttavia, questi modelli non sono rappresentativi del vero micro-ambiente tumorale, che colpisce le risposte chemioterapeutiche14,15,16. Attualmente il 96% dei farmaci chemioterapici fallisce durante gli studiclinici 14.  Questa elevata incidenza nei tassi di attrito dei farmaci può essere attribuita al fatto che i modelli di pre-screening in vitro disponibili non rappresentano pienamente la nostra attuale visione e comprensione della complessità hcc e del microambiente16. Al contrario, i modelli animali in vivo presentano un sistema immunitario compromesso e discrepanze nelle interazioni tra il tumore e il microambiente rispettoall'uomo 16,17. In media solo l'8% dei risultati ottenuti da studi sugli animali può essere tradotto in modo affidabile dal contesto precli clinicalo a quelloclinico 16,17. Pertanto, è chiaro che la valutazione dell'HCC richiede lo sviluppo di una piattaforma in vitro che ricapitola efficacemente la complessità non solo del tumore ma anche del microambiente. Le piattaforme integrerebbe i modelli di screening preclino in vitro attualmente disponibili e ridurrebbe la quantità di studi sugli animali infuturo 7,14.
Una di queste piattaforme sono modelli avanzati di coltura cellulare tridimensionale (3D). Una moltitudine di questi modelli 3D avanzati per studiare HCC sono emersi nell'ultimo decennio e sono state pubblicate varie recensioni. I modelli 3D disponibili per studiare HCC includono sferoidi multicellulari, organoidi, modelli basati su impalcature, idrogel, microfluidici e bio-stampa. Di questi, gli sferoidi multicellulari sono uno dei modelli più noti utilizzati nello studio dello sviluppo tumorale. Gli sferoidi sono un modello economico con bassa difficoltà tecnica e allo stesso tempo imitano efficacemente l'architettura tumorale in vivo18,19,20. Gli sferoidi multicellulari hanno contribuito a una vasta gamma di informazioni su HCC17,21,22. Tuttavia, il tempo di coltura standardizzato è carente in quanto gli sferoidi multicellulari sono tenuti in coltura tra 7 e 48 giorni. L'aumento del tempo della cultura è di notevole importanza. Eilenberger ha scoperto che le differenze nell'età degli sferoidi influenzano profondamente la diffusività e la tossicità della Sorafenib (un inibitore della chinasi utilizzato per il trattamento dei tumori del fegato)23. Mentre Wrzesinski e Fey hanno scoperto che gli sferoidi epatociti 3D richiedono 18 giorni per ristabilire le funzioni fisiologiche chiave del fegato dopo la tripsidenza e continuano a mostrare la funzionalità stabile fino a 24 giorni dopo questorecupero 24,25.
Alcuni dei modelli HCC 3D più avanzati includono l'uso di impalcature epatiche decellularizzate umane e impalcature biostampate. Mazza e colleghi hanno creato un'impalcatura 3D naturale per la modellazione HCC utilizzando fegati umani decellularizzati non adatti al trapianto26. Queste impalcature naturali potrebbero essere ripopolate con successo per 21 giorni con una co-coltura di stellete epatiche e cellule epatoblastoma, pur mantenendo l'espressione di componenti chiave della matrice extracellulare come collagene di tipo I, III, IV e fibronectina. Oltre alla modellazione delle malattie, questo modello offre anche il vantaggio del trapianto funzionale di organi e dello screening preclinale di farmaci e tossicità26. Con i progressi della bio-stampa 3D, le impalcature a matrice extracellulare 3D possono ora essere biostampate.  Ma e colleghi, impalcature a matrice extracellulare biostampate con proprietà meccaniche variabili e microarchitettura biomimetica utilizzando idrogel ingegnere da matrice extracellulare decellularizzata27. Indubbiamente questi sono tutti eccellenti modelli HCC 3D. Tuttavia, l'indisponibilità di fegati umani e il costo necessario per l'acquisizione delle attrezzature e dei materiali necessari ingaliscono questi modelli in una posizione di svantaggio. Inoltre, questi metodi sono tutti tecnicamente avanzati che richiedono una formazione estesa che potrebbe non essere prontamente disponibile per tutti i ricercatori.
Sulla base della complessità di HCC e dei modelli 3D attualmente disponibili, abbiamo cercato di sviluppare un modello HCC 3D onnicomprensore. Abbiamo puntato a un modello in grado di ricapitolare sia il microambiente premalignante che quello tumorale incorporando valori di rigidità regolabili dell'idrogel.  Inoltre, abbiamo incluso anche linee cellulari associate all'epatocellulare e allo stroma, che svolgono un ruolo chiave nella patogenesi dell'HCC. Questi includono cellule endoteliali, cellule stellate epatiche ed epatociti maligni, coltivati in un microambiente composto da idrogel fisiologicamente rilevanti. Con gli idrogel scelti, collagene di tipo I e fibrinogeno, incorporati in rapporti paragonabili ai cambiamenti bio-fisici osservati nella rigidità epatica durante l'iniziazione e la progressione dell'HCC.  Inoltre, mirava a un modello che potesse essere mantenuto in cultura per un periodo di tempo prolungato. Abbiamo immaginato un modello modulare ed economico che può essere configurato con attrezzature di base, formazione ed esperienza minime e materiali prontamente disponibili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlamarBlue (Resazurin sodium salt)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">211-500</td>
			<td style="width:167px;">Prepare according to manufacturesr recommendations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;), Stabilized</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aprotinin Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78432</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016-2.5KG</td>
			<td style="width:167px;">Anhydrous, granular, &#8804;7.0 mm, &#8805;93.0%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Kebo Biomed Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning Black, clear flat bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS3904-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Corning HTS Transwell-24 well permeable supports</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>CLS3396-2EA</td>
			<td style="width:167px;">HTS Transwell-24 units w/ 0.4 &#956;m pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Discovery Hybrid Rheometer 2</td>
			<td style="width:71px;">TA instruments, Sollentuna, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61965059</td>
			<td>Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Applications, Inc</td>
			<td style="width:119px;">211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A3160902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibrinogen type I-S from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F8630-10G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FLUOstar Omega plate reader</td>
			<td style="width:71px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9394-500ML</td>
			<td>Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Labogene scanspeed 416 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Labogene, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:71px;">Kebo Biomed Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mettler Toledo AG245 Analytical Balance</td>
			<td style="width:71px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon TMS Light microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417-100TAB</td>
			<td style="width:167px;">Prepare according to manufacturers recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL</td>
			<td style="width:71px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">50201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653-1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B619298</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC20 Automated cell counter</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TC20 cell counter counting slides</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9549</td>
			<td style="width:167px;">Powder, suitable for cell culture, &#8805;1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trypsin (2.5%) 10x</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1x in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6414-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Solution, sterile-filtered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a biomimetic model for liver cancer to study tumor-stroma interactions in a 3d environment with tunable bio-physical properties

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore epatico primario che si sviluppa sulla scia della malattia epatica cronica. La malattia epatica cronica e l'infiammazione portano a un ambiente fibrotico che supporta e guida attivamente l'epatocarcinogenesi. La comprensione dell'epatocarcinogenesi in termini di interazione tra il micro-ambiente dello stroma tumorale e le cellule tumorali è quindi di notevole importanza. I modelli tridimensionali di coltura cellulare (3D) sono proposti come l'anello mancante tra gli attuali modelli di coltura cellulare 2D in vitro e i modelli animali in vivo. Il nostro obiettivo era quello di progettare un nuovo modello HCC biomimetico 3D con compartimento stromale fibrotico e vascucolatura. Idrogel fisiologicamente rilevanti come collagene e fibrinogeno sono stati incorporati per imitare le proprietà bio-fisiche dell'ECM tumorale. In questo modello le cellule LX2 ed HepG2 incorporate in una matrice di idrogel sono state seminate sull'inserto transmembrana invertito. Le cellule HUVEC sono state quindi seminate sul lato opposto della membrana. Sono state preparate tre formulazioni costituite da ECM-idrogel incorporati nelle cellule e le proprietà bio-fisiche sono state determinate dalla reologia. La vitalità delle cellule è stata determinata da un saggio di vitalità cellulare per 21 giorni. L'effetto della doxorubicina del farmaco chemioterapico è stato valutato sia nella co-coltura 2D che nel nostro modello 3D per un periodo di 72h. I risultati reologia mostrano che le proprietà bio-fisiche di un fegato fibrotico, cirrotico e HCC possono essere mimicked con successo. Nel complesso, i risultati indicano che questo modello 3D è più rappresentativo della situazione in vivo rispetto alle culture 2D tradizionali. Il nostro modello tumorale 3D ha mostrato una diminuzione della risposta alla chemioterapica, imitando la resistenza ai farmaci tipicamente osservata nei pazienti con HCC.

Intervalli di concentrazione e volume di semina L'ottimizzazione del protocollo per ottenere il protocollo di funzionamento finale si è verificata secondo il diagramma schematico presentato nella figura 3. Due idrogel fisiologicamente rilevanti, collagene di tipo I e fibrinogeno, sono stati identificati mediante una ricercabibliografica 35,36.  A partire dal collagene della coda di ratto di tipo I, una gamma di concentrazioni (4, 3, 2 e 1 mg/mL) è stata seminata su inserti invertiti per determinare la loro capacità di aderire con successo all'inserto una volta invertito di nuovo. Tutte le concentrazioni all'interno di questo intervallo erano in grado di formare gel, tuttavia i gel di collagene apparivano appiattiti e avevano varie bolle d'aria intrappolate al loro interno a causa della manipolazione e della pipettazione, vedi figura 4 e figura 5. Per determinare il volume ottimale della semina per migliorare la qualità del gel di collagene, una gamma di volumi di semina (100, 150 e 200 μL), è stata seminata su inserti invertiti, vedere figura 5.  Il volume di semina non ha avuto alcuna influenza sull'aspetto del gel o sulla presenza di bolle all'interno del gel. Di conseguenza, è stato deciso che 200 μL era il volume di semina ottimale producendo i gel più pieni. Fibrinogen è stato anche valutato per la sua capacità di produrre un gel in grado di aderire a un inserto per un periodo di tempo prolungato.  Un intervallo di concentrazione (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/mL) è stato preparato e seminato ad un volume di 200 μL sul coperchio di una piastra da 12 pozzi, vedi figura 6. Entro 20 minuti dalla semina tutte le concentrazioni sono state in grado di formare con successo un gel. Tuttavia, le concentrazioni di 5 e 1 mg/mL sono state escluse in quanto i gel formati avevano una consistenza fluida e avevano iniziato a staccarsi dal coperchio dopo essere stati tenuti durante la notte a 37 °C.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig3.jpg"> Figura 3: Diagramma schematico dell'ottimizzazione del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig4.jpg"> Figura 4: Gel di collagene 4 mg/mL contenenti 1,0 x 105 cellule/mL seminati su inserti che mostrano bolle presenti nel gel. L'inserto a sinistra è stato degassato sul ghiaccio per 15 minuti, mentre l'inserto a destra non è stato degassato. Il degassamento non ha avuto alcun effetto sulle bolle presenti nei gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig5.jpg"> Figura 5: Gel di collagene 4 mg/mL contenenti 1,0 x 105 cellule/mL seminati su inserti in volumi variabili. (A) Inserire a sinistra 100 μL, al centro 150 μL e a destra 200 μL, subito dopo la semina. Le bolle nei gel erano ancora presenti. (B) Inserire a sinistra 200 μL, al centro 150 μL e a destra 100 μL, dopo 60 minuti di reticolamento. Tutti i gel indipendentemente dal volume appaiono ancora piatti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig6.jpg"> Figura 6: Fibrinogeno (200 μL) in un intervallo di concentrazione compreso tra 70 e 1 mg/mL seminato sul coperchio di una piastra da 12 pozza. (A) Gel subito dopo la semina. (B) Gel 20 min dopo la semina. (C)Gel tenuti durante la notte. Tutti i gel appaiono ben arrotondati, i gel da 5 mg/mL e 1 mg/mL sono stati esclusi in quanto sembravano avere una consistenza più fluida 20 minuti dopo la semina e avevano iniziato a staccarsi dal coperchio dopo essere stati tenuti durante la notte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Combinazione di collagene e fibrinogeno Sulla base dei risultati delle gamme di concentrazione di collagene e fibrinogeno è stato valutato l'effetto della combinazione del collagene e del fibrinogeno. Sono stati inseriti tre inserti con il seguente collagene da 4 mg/mL, 20 mg/mL di fibrinogeno e una razione 1:1 di collagene (4 mg/mL) e fibrinogeno (20 mg/mL), vedi figura 7. Subito dopo aver seminato gli idrogel, abbiamo osservato che l'inserto con collagene da solo aveva ancora un aspetto piatto combinato con il verificarsi di bolle all'interno del gel. Gli inserti con fibrinogeno hanno prodotto un gel pieno e arrotondato, così come l'inserto con la combinazione di collagene e fibrinogeno. Dopo il collegamento incrociato a 37 °C per 60 min, tutti i gel si erano attaccati all'inserto e sono rimasti attaccati dopo l'incubazione notturna a 37 °C.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig7.jpg"> Figura 7: Effetto della combinazione di collagene e fibrinogeno. (A) Collagene 4 mg/mL seminato su inserto a sinistra, fibrinogeno 20 mg/mL seminato su inserto nel mezzo e collagene 4 mg/mL, fibrinogeno 20 mg/mL (1:1 razione) seminato su inserto a destra. Tutti i gel seminati ad un volume di 200 μL contenente 1,0 x 105 cellule/mL, tutti i gel sono stati reticolati per 60 min a 37 °C.(B)Collagene 4 mg/mL 60 min dopo il retillo, il gel è apparso piatto e ha avuto bolle. (C) Inserire sul fibrinogeno sinistro 20 mg/mL, il gel appare arrotondato, senza bolle presenti, inserire sul collagene destro 4 mg/mL, fibrinogeno 20 mg/mL gel, il gel è ben arrotondato senza bolle. (D) Collagene 4 mg/mL gel dopo essere stato tenuto durante la notte a 37 °C, il gel conteneva ancora una grande quantità di bolle, si è verificato un certo gonfiore del gel. (E) Fibrinogeno 20 mg/mL conservato durante la notte a 37 °C. (F) Collagene 4 mg/mL, fibrinogeno 20 mg/mL gel conservato durante la notte a 37 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig7large.jpg" target="_blank">questa cifra.</a>
Determinazione della densità di semina cellulare Sulla base della precedente esperienza di lavoro con idrogel, è stato impostato un esperimento per determinare la densità ottimale di semina cellulare (dati non mostrati)37. Le cellule sono state incorporate in una combinazione di collagene e fibrinogeno nel seguente intervallo di concentrazione (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1,0 x 106, 1,5 x 106 e 2,0 x 106 celle/mL), 2,0 x 106 celle/mL sono risultati essere la densità di semina ottimale.
Reologia Dieci formulazioni delle combinazioni fibrinogeno e idrogel di collagene sono state valutate per via reologia, cfr. L'obiettivo era quello di determinare quale di queste formulazioni potesse imitare la rigidità epatica osservata durante lo sviluppo dell'HCC. La letteratura ha fornito valori noti di rigidità epatica per ratti, topi e esseri umani durante la fibrosi, la cirrosi e l'HCC e l'obiettivo eraquello di avvicinarsi il più possibile a questi valori 28,29,30,31,32. Le dieci formulazioni di cui alla tabella 2 sono state preparate in triplice copia e il modulo di immagazzinamento di ciascuna di essi è stato determinato utilizzando un reometro, risultati riportati nella figura 8.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulazione</td>
			<td>Fibrinogeno (mg/ml)</td>
			<td>Collagene (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Combinazioni di collagene e fibrinogeno in varie concentrazioni valutate con reologia per determinare i valori di rigidità
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig8.jpg"> Figura 8: Valori di rigidità dell'idrogel per combinazioni di collagene e fibrinogeno in varie concentrazioni valutate con reologia. Il modulo di archiviazione e il modulo di perdita sono stati determinati a 37 °C e 1Hz per mezzo di un rheometro ibrido Discovery HR-2 (n = 3, barre di errore = SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Da queste dieci formule tre sono state scelte per procedere. Tra questi, 2 mg/mL di collagene di tipo I e 10 mg/mL di fibrinogeno corrispondente ai valori di rigidità epatica all'inizio della fibrosi, 2 mg/mL di collagene di tipo I e 30 mg/mL di fibrinogeno corrispondente alla cirrosi e 2 mg/mL di collagene di tipo I e 40 mg/mL di fibrinogeno corrispondente all'HCC, cfr.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig9.jpg"> Figura 9: Valori di rigidità dell'idrogel per varie formulazioni di idrogel fibrinogeno/collagene scelte per continuare.  Modulo di memorizzazione e modulo di perdita sono stati determinati a 37 °C e 1 Hz (n = 3, barre di errore = SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Vitalità, risposta ai farmaci e potenziale metastatico I risultati del saggio AlamarBlue hanno mostrato una ridotta vitalità cellulare complessiva all'interno della cocoltura 2D, inferiore al previsto in base ai valori IC 25, 50 e 75 segnalati, rispetto al controllo non trattato, vedere figura 10. Questo può essere attribuito alle cellule LX2 nella nostra co-coltura che sono più sensibili al trattamento con doxorubicina. Tuttavia, nel nostro modello 3D abbiamo notato e aumentato la resistenza alla doxorubicina, confermando la diminuzione del potenziale chemioterapico spesso osservata nei sistemi modello 3D. La significatività statistica rispetto ai controlli è stata valutata utilizzando il test Student T (a due code), con P<0.05 considerato significativo.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig10.jpg"> Figura 10: Percentuale di vitalità cellulare di un modello di cocoltura 2D rispetto al modello 3D dopo il trattamento con Doxorubicina a varie concentrazioni per un periodo di 72h. Risultati normalizzati rispetto al controllo non trattato (n=3, barre di errore = SD) (* = p<0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I costrutti di gel sono stati ispezionati visivamente ogni giorno utilizzando un microscopio leggero per seguire la crescita cellulare all'interno di diverse concentrazioni degli idrogel. Le cellule riempivano gli idrogel in modo omogeneo e compatto, dal giorno 7 gli sferoidi iniziarono ad assemblarsi all'interno della matrice.

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A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Questo protocollo presenta un modello biomimetico 3D con compartimento stromale fibrotico di accompagnamento. Preparato con idrogel fisiologicamente rilevanti in rapporti che imitano le proprietà bio-fisiche della matrice extracellulare stromale, mediatore attivo delle interazioni cellulari, della crescita tumorale e della metastasi.

Un modello biomimetico per il cancro al fegato per studiare le interazioni tumore-stroma in un ambiente 3D con proprietà bio-fisiche tonnibili

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.1K Views.  Uppsala University. Questo protocollo presenta un modello biomimetico 3D con compartimento stromale fibrotico di accompagnamento. Preparato con idrogel fisiologicamente rilevanti in rapporti che imitano le proprietà bio-fisiche della matrice extracellulare stromale, mediatore attivo delle interazioni cellulari, della crescita tumorale e della metastasi.

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Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Studio di vettori virali in un tridimensionale fegato Modello ripopolata con l&#39;Umano carcinoma epatocellulare Linea cellulare HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Development and Angiographic Use of the Rabbit VX2 Model for Liver Cancer

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of Interventional Radiology. This model employs an anaplastic squamous cell carcinoma that is easily and reliably propagated in the skeletal muscle of donor rabbits for eventual harvest and allograft implantation into the liver of na&#239;ve recipients. This tumor graft rapidly grows within the liver of recipient rabbits into an angiographically identifiable tumor characterized by a necrotic core surrounded by a viable hypervascular capsule. The physical size of the rabbit anatomy is sufficient to facilitate vascular instrumentation allowing for the application and testing of various interventional techniques. Despite these benefits, there exists a paucity of technical resources to act as a concrete reference for researchers working with the model. Herein, we present a comprehensive visual outline for the technical aspects of development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 tumor model for use by novice and experienced researchers alike.

The goal of this article is to provide a primer for the development and use of the VX2 carcinoma rabbit model for liver cancer.

Sviluppo e uso angiografica del coniglio VX2 modello per cancro del fegato

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, depending on the cancer type. To reduce the brain metastatic tumor burden, gaps in basic and translational knowledge need to be addressed. Major challenges include a paucity of reproducible preclinical models and associated tools. Three-dimensional models of brain metastasis can yield the relevant molecular and phenotypic data used to address these needs when combined with dedicated analysis tools. Moreover, compared to murine models, organ-on-a-chip models of patient tumor cells traversing the blood brain barrier into the brain microenvironment generate results rapidly and are more interpretable with quantitative methods, thus amenable to high throughput testing. Here we describe and demonstrate the use of a novel 3D microfluidic blood brain niche (&#181;mBBN) platform where multiple elements of the niche can be cultured for an extended period (several days), fluorescently imaged by confocal microscopy, and the images reconstructed using an innovative confocal tomography technique; all aimed to understand the development of micro-metastasis and changes to the tumor micro-environment (TME) in a repeatable and quantitative manner. We demonstrate how to fabricate, seed, image, and analyze the cancer cells and TME cellular and humoral components, using this platform. Moreover, we show how artificial intelligence (AI) is used to identify the intrinsic phenotypic differences of cancer cells that are capable of transit through a model &#181;mBBN and to assign them an objective index of brain metastatic potential. The data sets generated by this method can be used to answer basic and translational questions about metastasis, the efficacy of therapeutic strategies, and the role of the TME in both.

Here, we present a protocol for preparing and culturing a blood brain barrier metastatic tumor micro-environment and then quantifying its state using confocal imaging and artificial intelligence (machine learning).

Quantificare il micro-ambiente del tumore metastatico del cervello utilizzando un modello 3D a chip Organ-On-A, apprendimento automatico e tomografia confocale