Diese Forschung wurde durch Stipendien der Schwedischen Krebsstiftung (Cancerfonden, CAN2017/518), der Schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung (SSMF, S17-0092), der O.E. och Edla Johanssons Stiftung und der Olga Jönssons Stiftung finanziert.  Diese Finanzierungsquellen waren nicht an der Studiengestaltung beteiligt; Erhebung, Analyse und Interpretation von Daten; Erstellung des Berichts; und in der Entscheidung, den Artikel zur Veröffentlichung vorzulegen. Der 3D-Druck von kundenspezifischen Abstandshaltern, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurde in der 3D-Druckanlage der Universität Uppsala in der Disziplin-Domäne für Medizin und Pharmazie durchgeführt, U-PRINT@mcb.uu.se. Wir danken Paul O'Callaghan für seinen wertvollen Beitrag zu unserem Projekt.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig1.jpg"> Abbildung 1: Grafische Darstellungen der Erstellung des 3D-biomimetischen HCC-Modells <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
ANMERKUNG: Der gesamte Workflow dieses Protokolls ist in den Abbildungen von Abbildung 1
1. Herstellung von Fibrinogen-Stammlösung
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 M Calciumchlorid (CaCl2) Stofflösung vor, indem Sie 2,21 g CaCl2 wiegen und zu 20 ml destilliertem Wasser (dH2 O)hinzufügen. Die Lagerlösung kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 20 ml Aprotinin-Lagerlösung (1218,75 KIU/ml) vor, indem Sie 5 mg Aprotinin wiegen und zu 20 mldH2O. Aliquot-Lagerlösung in 1 ml Aliquot-Lageraufsatz aufbewahren und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10 ml von 80 mg/ml Fibrinogen-Stammlösung vor.<ol>
<li>In einem 50 ml-Rohr 7,849 ml Phosphatgepufferte Saline (PBS), 2.051 ml Aprotininbestand (1218,75 KIU/ml) für eine endgültige Aprotininkonzentration von 250 KIU/ml und 100 l CaCl2 (1M) für eine endgültige CaCl2-Konzentration von 10 mM hinzufügen.</li>
		<li>Wiegen Sie 800 mg Fibrinogen.</li>
		<li>Wiegen Sie 200 mg Natriumchlorid (NaCl) für die Stammlösung mit 2% w/v NaCl.</li>
		<li>Fügen Sie das Fibrinogen und NaCl in Schritten in das 50 ml-Rohr, das DIE PBS, Aprotinin und CaCl2enthält. Nicht kräftig rühren oder schütteln, da dies zu fibrinogener Gelierung und Klumpenbildung in der Lösung führt.</li>
		<li>Das 50 ml-Rohr der Fibrinogen-Stammlösung horizontal auf einen Shaker legen und bei einer niedrigen Einstellung von 300 U/min schütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald sich die Lösung gelöst hat, filtern Sie sie je nach Volumen mit einem Spritzenfilter oder einem Flaschentopfilter. Wichtig ist, autoklavieren Sie nicht die Fibrinogen-Lösung, da dies das Fibrinogen zerstören wird. HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls kann je nach Menge der Lagerlösung zwischen 2 und 5 h dauern, diese Zeit sollte während des Versuchsaufbaus berücksichtigt werden.</li>
</ol>2. Beschichtungseinsätze mit Kollagen vor der Aussaat der Hydrogele auf die Einsätze
<ol><li>In einer laminaren Strömungshaube oder einer Gewebekulturhaube, mit sterilisierter Pinzette, entfernen Sie Einsätze von der Platte und legen Sie invertiert auf den Deckel der Platte.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 100 ml 20 mM Eisessig-Lagerlösung vor, indem Sie 115 l Eisessigsäure zu 25 ml dH2O hinzufügen und sich auf ein Endvolumen von 100 ml mit dH2O einstellen. Filtern Sie die Lösung mit einem Spritzenfilter von 0,22 m. Lagerlösung kann bei RT gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 ml einer Kollagenlösung mit 100 g/ml aus einer 5 mg/ml Kollagenlösung vor, indem Sie 40 l der 5 mg/ml Kollagenlösung zu 1,960 ml der 20 mM Eisassigsäure-Stammlösung, die in 2.2 hergestellt wird, hinzufügen.</li>
	<li>Beschichten Sie die Einsätze mit der in 2,3 hergestellten Kollagenlösung von 100 g/ml, indem Sie 100 l der Lösung auf jeden Einsatz pipetieren. Lassen Sie die Luft in der laminaren Strömungshaube oder Gewebekulturhaube für 2 bis 3 h trocknen.</li>
	<li>Sobald die Einsätze getrocknet haben, waschen Sie jeden Einsatz 3x mit PBS. Fügen Sie 1 ml PBS zu jedem Brunnen einer 12 Wellplatte hinzu, legen Sie die Einsätze mit Kollagenbeschichtung nach unten in die Brunnen, entfernen PbS aus dem Brunnen und wiederholen Sie den Vorgang. Lassen Sie die Luft trocken in die laminare Strömungshaube 1 bis 2 h. VORSICHT: Essigsäure ist toxisch für Zellen und Einsätze sollten gründlich mit PBS gewaschen werden.</li>
	<li>Fügen Sie einen benutzerdefinierten 3D-gedruckten Abstandhalter über die Einsätze, wird dies notwendig sein, sobald die Gele hängen von der Einlage, um zu verhindern, dass sie die untere Bohrung der Platte berühren(Abbildung 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig2.jpg"> Abbildung 2: Benutzerdefinierter 3D-gedruckter Abstandsraum <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="7"><li>Bedecken Sie die invertierten Einsätze mit dem unteren Teil der Platte und legen Sie sie in den Inkubator, bis die Zellen in die Hydrogele eingebettet sind und zur Aussaat bereit sind.</li>
</ol>3. In Hydrogele eingebettete Saatzellen auf Einsätze
ANMERKUNG: Tabelle 1 enthält eine Beschreibung von 3 Formulierungen mit unterschiedlichen Konzentrationen fibrinogen, die vorbereitet werden. Formulierung eins entspricht der Leber während des Beginns der Fibrose, zwei Zirrhose und drei HCC, die Steifigkeitswerte für jede dieser Formulierungen wurden mit Rheologie während der Protokolloptimierung bestimmt.
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulierung</td>
			<td>Endgültige Fibrinogenkonzentration (mg/ml)</td>
			<td>Endgültige Kollagenkonzentration (mg/ml)</td>
			<td>Zellen (LX2 + HepG2 Co-Culture 1:1)</td>
			<td>Stadium der Leber</td>
			<td>Literatur Lebersteifigkeitswerte (kPa)</td>
			<td>Modellsteifigkeitswert aus Rheologie (kPa)</td>
			<td>Formulierung</td>
			<td>Fibrinogen hinzuzufügen (mL)</td>
			<td>Kollagen zum Hinzufügen (mL)</td>
			<td>10 % DMEM (mL)</td>
			<td>Thrombin (L)</td>
			<td>
Referenzs</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 Zellen/ml</td>
			<td>Fibrose</td>
			<td>≥2</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4</td>
			<td>28; 29; 30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 Zellen/ml</td>
			<td>Zirrhose</td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>2</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.45</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 Zellen/ml</td>
			<td>Hcc</td>
			<td>10 ≥</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1</td>
			<td>28; 31; 32</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Beschreibung von Formulierungen für Säzellen, die in Hydrogele auf Inserts eingebettet sind
<ol><li>Bereiten Sie 1 M Natriumhydroxid-Stammlösung vor, indem Sie 3,99 g NaOH zu 100 ml dH2O hinzufügen.  Die Lösung kann dann mit einem 0,22 m Spritzenfilter gefiltert werden. Bewahren Sie die Lagerlösung bei RT auf.</li>
	<li>5 mg/ml Kollagen und 10 ml 1 M NaOH auf Eis legen.</li>
	<li>50 ml PBS, 15 ml Trypsin, 70 ml 10% DMEM und Fibrinogen-Stammlösung, in Abschnitt 1, auf 37 °C für 20 min in einem Wasserbad vorheizen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellsuspensionen vor.<ol>
<li>Waschen Sie leberstellate Zellen (LX2) und Leberkarzinom (HepG2) Zellen in T175-Kulturkolben zweimal mit 10 ml PBS.</li>
		<li>Trypsinize-Zellen mit 6 ml Trypsin für 4 min bei 37 °C.</li>
		<li>Inaktivieren Sie Trypsin mit 6 ml von 10% DMEM.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellsuspension in 15 ml Rohr und Zentrifuge für 3 min bei 300 x g.</li>
		<li>Nach der Zentrifugation den Überstand ansaugen und jede Zelllinie in 5 ml 10% DMEM wieder aufsetzen.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler: Fügen Sie 10 L jeder Zellsuspension zum Zählkammerschlitten hinzu, und legen Sie das Dia in den Zellzähler ein. Die Zellanzahl wird als Zellen/ml angezeigt.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen aus jeder Zelllinie auf 1 x 106 Zellen pro ml mit der Zellzahl in Schritt 3.4.6 in deutlich markierte 15 ml-Röhren. Zentrifugieren Sie die Verdünnungen für 3 min bei 300 x g.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach der Zentrifugation, aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 10% DMEM zu jedem 15 ml Rohr nach Tabelle 1, Werte in der Tabelle angegeben ist für 2 ml jeder Formulierung.</li>
	<li>Neutralisieren Sie die Menge an Kollagen mit 10 L/ml NaOH (1 M), und fügen Sie das neutralisierte Kollagen zur Zellsuspension hinzu, das 10% DMEM-Geschenk wird gelb, sobald die Suspension gründlich durch Pipettieren mit einer Schnittspitze gemischt wird, wird es ein helles Rosa drehen.</li>
	<li>Fügen Sie Fibrinogen in die Kollagenzellsuspension nach Tabelle 1, mit einer geschnittenen Pipettenspitze, mischen Sie die Suspension gründlich.</li>
	<li>Fügen Sie Thrombin schließlich zu Kollagen-Fibrinogen-Zellsuspension, 0,1 KIU Thrombin für jede 10 mg Fibrinogen.</li>
	<li>Entfernen Sie die in Abschnitt 2 hergestellten vorbeschichteten invertierten Einsätze aus dem Inkubator und verwenden Sie eine geschnittene 200-L-Pipettenspitze, Pipette 200 l der vorbereiteten Suspension auf die vorgesehenen Einsätze. Lassen Sie die Gele für 15 min innerhalb der laminaren Strömungshaube vernetzen.</li>
	<li>Nach 15 min den unteren Teil der Platte vorsichtig über die Gele legen und zum Inkubator bewegen, damit sich die Gele 45 min bei 37 °C vernetzen können.</li>
	<li>Sobald die Gele vernetzt sind, invertieren Sie die Einsätze erneut und fügen Sie 2 ml 10% DMEM zu jeder der unteren Brunnen der Platte hinzu.</li>
</ol>4. Aussaat endotheliale Zellen
<ol><li>25 ml hanks balanced salt solution (HBSS), 10 ml Trypsin, 10 ml Trypsin-Inhibitor und 50 ml endotheliale Wachstumsmedium vorheizen, auf 37°C für 20 min in einem Wasserbad.</li>
	<li>Bereiten Sie die endotheliale (HUVEC) Zellsuspension vor.<ol>
<li>HUVEC-Zellen in T175-Kulturkolben zweimal mit 10 ml HBSS waschen.</li>
		<li>Trypsinize-Zellen mit 6 ml Trypsin für 4 min bei 37 °C. Inaktivieren Sie Trypsin mit 6 ml Trypsin-Inhibitor. Sammeln Sie die Zellsuspension in 15 ml Rohr und Zentrifuge für 3 min bei 200 x g.</li>
		<li>Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand und suspendieren die Zellen in 5 ml endothelialem Wachstumsmedium.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen wie zuvor in 3.4.6 beschrieben mit einem automatisierten Zellzähler.</li>
		<li>Mit der Zellzahl aus dem Zellzähler die Saatdichte von 1,0 x 104 Zellen/ml im endothelialen Wachstumsmedium vorzubereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Samen 500 l der HUVEC-Zellsuspension in jede Bohrung des oberen Teils des Inserts, um ein Endvolumen von 5,0 x 103 Zellen pro Einsatz zu haben.</li>
</ol>5. Wartung
<ol><li>Ersetzen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag, Aspirat verbrachte Wachstumsmedium sowohl aus dem Brunnen und der Einsatz. Fügen Sie den Brunnen, die das Gel enthalten, und 0,5 ml endothelialem Wachstumsmedium 2 ml 10 % DMEM zu den Einsätzen hinzu, die die HUVEC-Zellen enthalten.</li>
	<li>Bewahren Sie das Modell 21 Tage vor dem Experimentieren auf.</li>
</ol>6. Rheologie
<ol><li>Messen Sie die Speichermoduli von Gelformulierungen, um Steifigkeitswerte mit einem Rheometer anzuzeigen, indem Sie Frequenzsweeps von 0,1-20 Hz bei 0,267 % und 37 °C durchführen, mit einer konstanten Axialkraft von 0,1N unter Verwendung einer parallelen Edelstahlgeometrie mit einem Durchmesser von 8 mm.</li>
</ol>7. Lebensfähigkeit und Arzneimittelreaktion
<ol><li>Bestimmen Sie die Wirkstoffreaktion und Lebensfähigkeit in 2D-Kokulturen und 3D-Modell.<ol>
<li>Saat-HepG2-Zellen (5,0 x 103 Zellen/ml) und LX2 (5,0 x 103 Zellen/ml) Zellen im Verhältnis 1:1 für die 2D-Kokultur in eine schwarze klare untere 96-Well-Platten bei einer Sädichte von 1,0 x 104 Zellen/ml.  Lassen Sie Zellen über Nacht anheften.</li>
		<li>Richten Sie das 3D-Modell so ein, dass es einer zirrhotischen Umgebung mit einem Steifigkeitswert von 6 kPa entspricht.  Halten Sie das Modell 21 Tage vor der Behandlung mit Doxorubicin aufrecht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zwei Stunden vor der Doxorubicin-Behandlung, aspirieren Sie das Kulturmedium aus dem 2D- und 3D-Modell. Waschen Sie beide Modelle zweimal mit PBS. Fügen Sie das Hungermedium (DMEM ergänzt durch 1% v/v Antimykotikanti-Lösung) in die 2D-Kokultur (200 l pro Brunnen) und zum 3D-Modell (2 ml zu den Brunnen, die das Hydrogel enthalten, und 500 l zum Einsatz) hinzu.</li>
	<li>Doxorubicin sowohl dem 2D- als auch dem 3D-Modell andiebe.  Dosierungen sind wie folgt: 0,5, 1 und 1,5 mM entsprechend den IC25-, 50- bzw. 75-Werten.  Behandeln Sie beide Modelle für 72 h. HINWEIS: Doxorubicin, ein Topoisomerase-II-Hemmer, ist eines der ersten Chemotherapeutikums, das für HCC verwendet wird, und ist auch eines der aktivsten Chemotherapeutika bei der Behandlung von HCC33,34.</li>
	<li>Nach 72 h, angesaugt Kulturmedium aus dem 2D-und 3D-Modell. Stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Kulturmedien entfernt werden, indem Sie beide Modelle zweimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Bereiten Sie AlamarBlue gemäß den Herstellerempfehlungen vor und fügen Sie die Brunnen des 2D- und 3D-Modells hinzu. Fügen Sie 150 l pro Brunnen für die 2D-Kultur und 2 ml pro Brunnen und 500 l pro Einsatz für 3D-Kultur hinzu.  Über Nacht bei 37°C inkubiert.</li>
	<li>Nach der Inkubationsübertragung 150 l des AlamarBlue aus jedem Brunnen des 3D-Setups in eine schwarze, klare 96-Well-Platte. AlamarBlue kann direkt von der Platte für das 2D-Modell abgelesen werden.</li>
	<li>Lesen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikroplattenleser bei Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge von 485 bzw. 550 nm.</li>
	<li>Berechnen Sie die prozentuale Zelllebensfähigkeit in beiden Modellen mit der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61606/61606eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).</li><li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+liver+spheroids+exhibit+stable+physiological+functionality+for+at+least+24+days+after+recovering+from+trypsinisation.">Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation.</a> Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+of+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+3D+bioprinting+of+decellularized+extracellular+matrix+with+regionally+varied+mechanical+properties+and+biomimetic+microarchitecture.">Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture.</a> Biomaterials. 185, 310-321 (2018).</li><li>Mueller, S., Sandrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stiffness:+a+novel+parameter+for+the+diagnosis+of+liver+disease.">Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease.</a> Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).</li><li>Wang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+liver+stiffness+in+a+rat+model+of+hepatic+fibrosis+with+acoustic+radiation+force.">In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).</li><li>Georges, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+liver+stiffness+of+the+rat+liver+precedes+matrix+deposition:+implications+for+fibrosis.">Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).</li><li>Massironi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+Liver+stiffness+and+hepatocellular+carcinoma:+is+it+really+useful.">et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful.</a> Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stiffness+is+associated+with+risk+of+decompensation,+liver+cancer,+and+death+in+patients+with+chronic+liver+diseases:+A+systematic+review.">Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).</li><li>Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. 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R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+for+hepatocellular+carcinoma:+the+present+and+the+future.">Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future.</a> World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).</li><li>Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cues+guiding+matrix+stiffness+in+liver+fibrosis.">Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis.</a> BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).</li><li>Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-related+proteins+in+tissue+repair:+how+a+unique+domain+with+common+structure+controls+diverse+aspects+of+wound+healing.">Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing.</a> Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).</li><li>Smit, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+alginated+encapsulated+LS180+spheroid+model+for+anti-colorectal+cancer+compound+screening.">Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).</li><li>Schrader, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+modulates+proliferation,+chemotherapeutic+response,+and+dormancy+in+hepatocellular+carcinoma+cells.">Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells.</a> Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).</li><li>Lachowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+modulates+the+activity+of+MMP-9+and+TIMP-1+in+hepatic+stellate+cells+to+perpetuate+fibrosis.">Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis.</a> Scientific Reports. 9, 7299 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Erstellung eines biomimetischen Modells für HCC. Es wurde ein klarer Workflow eingerichtet und die damit verbundenen kritischen Schritte identifiziert. Zu diesen kritischen Schritten gehören die Herstellung der Fibrinogen-Stammlösung, die Beschichtung der Einsätze mit Kollagen und die Aussaat der in das Hydrogel eingebetteten Zellen. Bei der Herstellung der Fibrinogen-Stammlösung ist es wichtig, das Fibrinogen in kleineren Schritten in höheren Konzentrationen hinzuzufügen. Dies wird nicht nur die Zeit reduzieren, die es für das Fibrinogen benötigt, um sich aufzulösen, sondern auch verhindern, dass das Fibrinogen inkonsistent und vorzeitig gegelt, wie in Abbildung 11zu sehen ist. Die Herstellung des Fibrinogengels nimmt viel Zeit in Anspruch und kann den gesamten experimentellen Erfolg beeinflussen. Ergebnisse zeigen, dass, sobald das Fibrinogen Gel beginnt, inkonsistent zu gelen, ist es am besten, es zu verwerfen. Die Einsätze sollten mit Kollagen beschichtet, mit PBS gewaschen und in der laminaren Strömungshaube getrocknet werden, bevor die in Hydrogele eingebetteten Zellen gesät werden. Wenn nicht sichergestellt wird, dass die Einsätze trocken sind, werden die Hydrogele über die Ränder des Einsatzes auslaufen, was zu einem ungleichmäßigen Gel führt. Ungleichmäßigkeit des Gels wird letztlich die Ergebnisse beeinflussen, bei denen die Diffusion ein Faktor ist.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig11.jpg"> Abbildung 11: Herstellung von Fibrinogen-Gel für Fibrinogen/Kollagen-Hydrogel-Formulierungen. (A) Fibrinogen-Gellösung, die Klumpen gebildet hat und begann, vorzeitig mit ungelöstem Fibrinogen zu gelieren, das an der Röhre haften. (B) Fibrinogen-Gellösung, die sich vollständig aufgelöst hat, Lösung ist klar und etwas zähflüssiger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Es wird empfohlen, so schnell wie möglich zu arbeiten, während die Hydrogelzellsuspension auf die Einsätze gesetzt wird, da die Fibrinogenkomponente mit der Zugabe von Thrombin zu vernetzen beginnt.  Bereiten Sie kleinere Arbeitsvolumina zu einem Zeitpunkt vor, wenn Sie mit Gelsuspensionen in höheren Konzentrationen arbeiten, um zu verhindern, dass das Gel während der Aussaat vernetzt. Letzteres wirkt sich auf die Verteilung und die Menge des auf jeden Brunnen gesäten Gelsausaus aus. Die Reihenfolge des Hinzufügens der Komponenten ist entscheidend, in diesem Protokoll haben wir einen optimierten Workflow bereitgestellt, um zu verhindern, dass Gele vorzeitig vernetzen.  Aufgrund der Viskosität der Hydrogelsuspension wird beim Mischen und Messen die Arbeit mit einer geschnittenen Pipettenspitze empfohlen.  Beim Mischen der Suspension stellen Sie sicher, dass dies schnell und gleichmäßig erfolgt, um eine homogene Suspension zu erzeugen. Ungleichmäßiges Mischen führt zu einem heterogenen Gel, das sich negativ auf die Ergebnisse auswirkt, siehe Abbildung 12.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig12.jpg"> Abbildung 12: Kollagen/Fibrinogen-Gele, die auf 12 Brunnenplatten gesät werden. Alle Gele mit einem Volumen von 200 l mit 2mg/ml Kollagen und 20 mg/ml Fibrinogen mit 2,0 x 106 Zellen/ml. (A) Hydrogelgel mit heterogener Konsistenz, sichtbare ungleichmäßige Verteilung der Hydrogele. (B) Hydrogele homogen gemischt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig12large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Im Anschluss an die Protokolloptimierung wurde das Modell ausgewertet, um die biophysikalischen Eigenschaften der Modelle zu bestimmen. Rheologische Daten zeigten, dass unser Modell, bestehend aus physiologisch relevanten extrazellulären Matrixkomponenten, nämlich Kollagen Typ I und Fibrinogen, in der Lage war, die biophysikalischen Eigenschaften einer fibrotischen, zirritischen und HCC-Leber28,29,30,31,32nachzuahmen. Die Rekapitulation der Lebersteifigkeit in 3D-Modellen für HCC ist von erheblicher Bedeutung und wird bei der Modellentwicklung oft übersehen. Erhöhte Lebersteifigkeit hängt mit Chemotherapeutika Resistenz, Proliferation, Migration, und Ruhe in HCC38. Während die Aktivierung von hepatischen stellaten Zellen in HCC mit erhöhter extrazellulärer Matrixsteifigkeit verbunden ist, mit mehreren Signalwegen, die mit diesen hepatischen stellaten Zellen verbunden sind, die Mechanosensitivität zeigen39.
Die Einbeziehung von stroma assoziierten Zellen wie Leberstellatzellen und Endothelzellen in die Entwicklung von 3D-Modellen für HCC ist zunehmend relevant geworden. Studien zeigen, dass mehrzellige Sphäroide, die aus leberstellaten und HCC-Zellen bestehen, zu einer erhöhten Chemotherapeutikaresistenz und invasiven Migration führten, während sie das Aussehen des HCC-Tumors in vivo imitierten, verglichen mit einem PXT-Mäusemodell und menschlichen HCC-Gewebeproben17. Eine ähnliche Studie von Jung et al., 2017 fand multizelluläre Sphäroid bestehend aus hepatozellulärem Karzinom (Huh-7) und endotheliale (HUVEC) Zellen förderte Vaskularisierung und Aggressivität22. Diese Sphäroide zeigten Lebensfähigkeit bei deutlich höheren Konzentrationen von Doxorubicin und Sorafenib im Vergleich zu Huh-7 Monokultursphäroiden22. Die Bewertung der Lebensfähigkeit und Reaktion unseres Modells auf Doxorubicin, mit Steifigkeitswerten, die denen von HCC entsprechen, und der Einbeziehung von stroma assoziierten Zellen (LX2 und HUVEC), zeigte eine ähnliche Geringere Reaktion auf Chemotherapeutika im Vergleich zu einem 2D-Kokulturmodell.  So, effektiv imitieren Arzneimittelresistenz in der Regel bei Patienten und anderen 3D-HCC-Modelle gesehen.
Da es sich um ein modulares System handelt, kann das Modell durch die Zugabe weiterer extrazellulärer Matrixkomponenten, nämlich Laminin und Hyaluronsäure, verstärkt werden. Alternativ können die in diesem Modell verwendeten aktuellen Hydrogele durch synthetische Hydrogele wie Natriumalginat oder Chitosan ersetzt werden. Weitere Modifikationen am aktuellen Modell können die Substitution der Zelllinien durch primäre Zellkulturen sein, um ein noch physiologischeres Modell zu erzeugen, oder kombinationen anderer Tumor- und Stromalzelllinien.
So haben wir erfolgreich ein 3D-Modell mit abstimmbaren biophysikalischen Eigenschaften zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in HCC entwickelt.  Wir haben festgestellt, dass unser Modell repräsentativer für die In-vivo-Situation im Vergleich zu traditionellen 2D-Kulturen als Reaktion auf Doxorubicin ist. Es bleibt jedoch noch viel zu tun, wir hoffen, dieses Modell ausgiebig zu charakterisieren und das Modell als eine mögliche metastasierende Plattform zu erforschen, um komplexere und drängendere Fragen zu beantworten, die in der Studie HCC noch bleiben.

Hepatozelluläres Karzinom (HCC) umfasst 90% aller primären Leberkrebserkrankungen1,2. Mit 810.000 Todesfällen und 854.000 neu gemeldeten Fällen pro Jahr ist es derzeit die fünfthäufigste Krebsart weltweit mit einer der höchsten Inzidenzen von Sterblichkeit1. Die Entwicklung von HCC wird hauptsächlich auf Entzündungen im Zusammenhang mit chronischen Lebererkrankungen zurückgeführt, nämlich virale Hepatitis, chronischer übermäßiger Alkoholkonsum, metabolisches Syndrom, Fettleibigkeit und Diabetes1,3,4.  Die Entzündung im Zusammenhang mit diesen pathologischen Bedingungen führt zu Hepatozytenverletzungen und Sekretion verschiedener Zytokine, die hepatische stellate Zellen und entzündliche Zellen aktivieren und rekrutieren, um Fibrose zu initiieren5. Hepatische stellate Zellen sind für ihre Schlüsselrolle bei der Initiierung, Progression und Regression der Leberfibrose bekannt. Bei aktivierung differenzieren sie sich in Myofibroblasten wie Zellen mit kontraktilen, pro-inflammatorischen und pro-fibrinogenen Eigenschaften6,7,8. Die daraus resultierende Fibrose wiederum verursacht die Dysregulation der extrazellulären Matrix-Remodeling-Enzymaktivität, wodurch eine Umgebung entsteht, die durch eine insgesamt erhöhte Steifigkeit gekennzeichnet ist, die von der Sekretion von Wachstumsfaktoren begleitet wird, die weiter zur HCC-Pathogenese9,10beiträgt. Es ist diese kontinuierliche pathogene Rückkopplungsschleife zwischen Hepatozyten und der stromalen Umgebung, die die Krebsinitiierung, epitheliale zu mesenchymalen Übergängen (EMT), Angiogenese, metastasierendem Potenzial und veränderter Arzneimittelreaktion11,12,13antreibt.  Einblicke in die Hepatokarzinogenese im Hinblick auf das Zusammenspiel von Tumor und Tumormikro-Umgebung sind daher nicht nur aus mechanistischer, sondern auch aus Behandlungssicht von erheblicher Bedeutung.
Zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle werden überwiegend von 80% der Krebszellbiologen14verwendet. Diese Modelle sind jedoch nicht repräsentativ für die wahre Tumor-Mikro-Umgebung, die chemotherapeutische Reaktionen betrifft14,15,16. Derzeit scheitern 96% der Chemotherapeutika in klinischen Studien14.  Diese hohe Inzidenz von Medikamentenzermürbungsraten ist darauf zurückzuführen, dass verfügbare In-vitro-Vorscreening-Modelle unsere aktuelle Einsicht und unser Verständnis der HCC-Komplexität und der Mikroumgebung nicht vollständig repräsentieren16. Umgekehrt in vivo Tiermodelle mit geschwächtem Immunsystem und Diskrepanzen in Wechselwirkungen zwischen dem Tumor und der Mikroumgebung im Vergleich zu Menschen16,17. Im Durchschnitt können nur 8 % der Ergebnisse aus Tierstudien zuverlässig aus dem präklinischen in den klinischen Rahmen16,17übersetzt werden. Daher ist es klar, dass die Bewertung von HCC die Entwicklung einer In-vitro-Plattform erfordert, die die Komplexität nicht nur des Tumors, sondern auch der Mikroumgebung effektiv rekapituliert. Die Plattformen würden die derzeit verfügbaren vorklinischen Screening-Modelle in vitro ergänzen und die Anzahl der Tierstudien in Zukunft reduzieren7,14.
Eine solche Plattform sind fortschrittliche dreidimensionale (3D) Zellkulturmodelle. Eine Vielzahl dieser fortschrittlichen 3D-Modelle zur Untersuchung von HCC sind in den letzten zehn Jahren entstanden und verschiedene Bewertungen wurden veröffentlicht. Verfügbare 3D-Modelle zur Untersuchung von HCC umfassen mehrzellige Sphäroide, Organoide, Gerüstmodelle, Hydrogele, Mikrofluidik und Biodruck. Davon sind mehrzellige Sphäroide eines der bekanntesten Modelle, die bei der Untersuchung der Tumorentwicklung verwendet werden. Sphäroide sind ein preiswertes Modell mit geringem technischen Schwierigkeitsgrad und imitieren gleichzeitig effektiv in vivo Tumorarchitektur18,19,20. Mehrzellige Sphäroide haben zu einer Fülle von Informationen über HCC17,21,22beigetragen. Es fehlt jedoch an standardisierter Kulturzeit, da mehrzellige Sphäroide zwischen 7 und 48 Tagen in der Kultur gehalten werden. Die Zeit der Kultur ist von erheblicher Bedeutung. Eilenberger fand heraus, dass die Unterschiede im Sphäroidalter Die Diffusivität und Toxizität von Sorafenib (ein Kinase-Hemmer zur Behandlung von Leberkrebs) tiefgreifendbeeinflussen. Während Wrzesinski und Fey fanden, dass 3D Hepatozyten sphäroide 18 Tage benötigen, um wichtige physiologische Leberfunktionen nach der Trypsinisierung wiederherzustellen und weiterhin die stabile Funktionalität für bis zu 24 Tage nach dieser Erholung24,25.
Einige der fortschrittlicheren 3D-HCC-Modelle umfassen die Verwendung von menschlichen dezellularisierten Lebergerüsten und biogedruckten Gerüsten. Mazza und Kollegen erstellten ein natürliches 3D-Gerüst für die HCC-Modellierung mit dezellularisierten menschlichen Lebern, die nicht für die Transplantation geeignetsind 26. Diese natürlichen Gerüste konnten erfolgreich für 21 Tage mit einer Kokultur von Leberstellat- und Hepatoblastomzellen wieder aufgefüllt werden, während die Expression wichtiger extrazellulärer Matrixkomponenten wie Kollagen Typ I, III, IV und Fibronectin beibehalten wurde. Abgesehen von der Krankheitsmodellierung bietet dieses Modell auch den Vorteil der funktionellen Organtransplantation und des präklinischen Arzneimittel- und Toxizitätsscreenings26. Mit den Fortschritten im 3D-Biodruck können nun auch extrazelluläre Matrixgerüste biogedruckt werden.  Ma und Kollegen, biogedruckte extrazelluläre Matrixgerüste mit variablen mechanischen Eigenschaften und biomimetische Mikroarchitektur mit Hydrogels Engineer aus dezellulisierter extrazellulärer Matrix27. Zweifellos sind dies alles ausgezeichnete 3D HCC Modelle. Die Nichtverfügbarkeit menschlicher Lebern und die Kosten für den Erwerb der notwendigen Ausrüstung und Materialien benachteiligen diese Modelle jedoch. Darüber hinaus sind diese Methoden alle technisch fortgeschritten und erfordern eine umfassende Ausbildung, die möglicherweise nicht allen Forschern zur Verfügung steht.
Basierend auf der Komplexität von HCC und derzeit verfügbaren 3D-Modellen haben wir uns bemüht, ein umfassendes 3D-HCC-Modell zu entwickeln. Wir strebten ein Modell an, das sowohl die prämaligne als auch die Tumormikroumgebung rekapitulieren kann, indem wir einstellbare Hydrogelsteifigkeitswerte einbauen.  Darüber hinaus haben wir auch hepatozelluläre und stromaassoziierte Zelllinien aufgenommen, die eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von HCC spielen. Dazu gehören Endothelzellen, hepatische Stellatzellen und bösartige Hepatozyten, die in einer Mikroumgebung aus physiologisch relevanten Hydrogelen angebaut werden. Mit den gewählten Hydrogelen, Kollagen Typ I und Fibrinogen, in Verhältnissen vergleichbar mit bio-physikalischen Veränderungen in der Lebersteifigkeit während der Einleitung und Progression von HCC gesehen.  Darüber hinaus strebten wir ein Modell an, das über einen längeren Zeitraum in der Kultur gehalten werden könnte. Wir stellten uns ein modulares, kostengünstiges Modell vor, das mit Grundausstattung, minimaler Schulung und Erfahrung und leicht verfügbaren Materialien eingerichtet werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlamarBlue (Resazurin sodium salt)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">211-500</td>
			<td style="width:167px;">Prepare according to manufacturesr recommendations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;), Stabilized</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aprotinin Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78432</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016-2.5KG</td>
			<td style="width:167px;">Anhydrous, granular, &#8804;7.0 mm, &#8805;93.0%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Kebo Biomed Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning Black, clear flat bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS3904-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Corning HTS Transwell-24 well permeable supports</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>CLS3396-2EA</td>
			<td style="width:167px;">HTS Transwell-24 units w/ 0.4 &#956;m pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Discovery Hybrid Rheometer 2</td>
			<td style="width:71px;">TA instruments, Sollentuna, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61965059</td>
			<td>Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Applications, Inc</td>
			<td style="width:119px;">211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A3160902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibrinogen type I-S from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F8630-10G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FLUOstar Omega plate reader</td>
			<td style="width:71px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9394-500ML</td>
			<td>Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Labogene scanspeed 416 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Labogene, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:71px;">Kebo Biomed Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mettler Toledo AG245 Analytical Balance</td>
			<td style="width:71px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon TMS Light microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417-100TAB</td>
			<td style="width:167px;">Prepare according to manufacturers recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL</td>
			<td style="width:71px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">50201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653-1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B619298</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC20 Automated cell counter</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TC20 cell counter counting slides</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9549</td>
			<td style="width:167px;">Powder, suitable for cell culture, &#8805;1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trypsin (2.5%) 10x</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1x in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6414-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Solution, sterile-filtered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a biomimetic model for liver cancer to study tumor-stroma interactions in a 3d environment with tunable bio-physical properties

Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist ein primärer Lebertumor, der sich im Gefolge einer chronischen Lebererkrankung entwickelt. Chronische Lebererkrankungen und Entzündungen führen zu einer fibrotischen Umgebung, die die Hepatocarcinogenese aktiv unterstützt und antreibt. Einsicht in die Hepatokarzinogenese im Hinblick auf das Zusammenspiel von Tumorstroma-Mikro-Umgebung und Tumorzellen ist daher von erheblicher Bedeutung. Dreidimensionale (3D) Zellkulturmodelle werden als fehlendes Bindeglied zwischen aktuellen in vitro 2D-Zellkulturmodellen und in vivo-Tiermodellen vorgeschlagen. Unser Ziel war es, ein neuartiges 3D-biomimetisches HCC-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach und Vaskulatur zu entwerfen. Physiologisch relevante Hydrogele wie Kollagen und Fibrinogen wurden eingebaut, um die biophysikalischen Eigenschaften des Tumors ECM nachzuahmen. In diesem Modell wurden LX2- und HepG2-Zellen, die in eine Hydrogelmatrix eingebettet sind, auf den invertierten Transmembraneinsatz gesetzt. HUVEC-Zellen wurden dann auf die gegenüberliegende Seite der Membran gesät. Drei Formulierungen, bestehend aus ECM-Hydrogelen, die mit Zellen eingebettet sind, wurden hergestellt und die biophysikalischen Eigenschaften wurden durch Rheologie bestimmt. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch einen Zelllebensfähigkeitstest über 21 Tage bestimmt. Die Wirkung des Chemotherapeutikums Doxorubicin wurde sowohl in der 2D-Kokultur als auch in unserem 3D-Modell für einen Zeitraum von 72h bewertet. Rheologie-Ergebnisse zeigen, dass biophysikalische Eigenschaften einer fibrotischen, zirrhose und HCC-Leber erfolgreich nachgeahmt werden können. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass dieses 3D-Modell repräsentativer für die In-vivo-Situation im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen ist. Unser 3D-Tumormodell zeigte eine verminderte Reaktion auf Chemotherapeutika und imitierte die Arzneimittelresistenz, die typischerweise bei HCC-Patienten zu beobachten ist.

Konzentrationsbereiche und Sävolumen Die Protokolloptimierung zur Erlangung des endgültigen Funktionsprotokolls erfolgte gemäß dem in Abbildung 3dargestellten Schemadiagramm. Zwei physiologisch relevante Hydrogele, Kollagen Typ I und Fibrinogen, wurden mittels einer Literaturrecherche35,36identifiziert.  Beginnend mit Rattenschwanzkollagen Typ I wurde eine Reihe von Konzentrationen (4, 3, 2 und 1 mg/ml) auf invertierte Einsätze gesetzt, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, erfolgreich an der Einlage zu haften, sobald sie wieder umgekehrt sind. Alle Konzentrationen innerhalb dieses Bereichs waren in der Lage, Gele zu bilden, aber Kollagengele erschienen abgeflacht und hatten verschiedene Luftblasen in sich gefangen wegen Handhabung und Pipettierung, siehe Abbildung 4 und Abbildung 5. Um das optimale Saatvolumen zur Verbesserung der Qualität des Kollagengels zu bestimmen, wurde eine Reihe von Sävolumina (100, 150 und 200 l) auf invertierte Einsätze gesetzt, siehe Abbildung 5.  Das Sävolumen hatte keinen Einfluss auf das Aussehen des Gels oder das Vorhandensein von Blasen im Gel. Dementsprechend wurde entschieden, dass 200 l das optimale Sävolumen sind, das die vollsten Gele produziert. Fibrinogen wurde auch für seine Fähigkeit bewertet, ein Gel zu produzieren, das über einen längeren Zeitraum an einem Einsatz haften könnte.  Ein Konzentrationsbereich (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/ml) wurde hergestellt und mit einem Volumen von 200 l auf den Deckel einer 12-Well-Platte gesät, siehe Abbildung 6. Innerhalb von 20 min nach der Aussaat konnten alle Konzentrationen erfolgreich ein Gel bilden. Die Konzentrationen 5 und 1 mg/ml wurden jedoch ausgeschlossen, da die gebildeten Gele eine flüssigkeitsähnliche Konsistenz hatten und begonnen hatten, sich vom Deckel zu lösen, nachdem sie über Nacht bei 37 °C gehalten worden waren.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig3.jpg"> Abbildung 3: Schematisches Diagramm der Protokolloptimierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig4.jpg"> Abbildung 4: Kollagengele 4 mg/ml mit 1,0 x 105 Zellen/ml, die auf Inserts gesetzt werden, die Blasen im Gel zeigen. Einsatz auf der linken Seite wurde auf Eis für 15 min entgast, während Einsatz auf der rechten Seite nicht entgast wurde. Die Entgasung hatte keinen Einfluss auf die Blasen in den Gelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig5.jpg"> Abbildung 5: Kollagengele 4 mg/ml mit 1,0 x 105 Zellen/ml, die in unterschiedlichen Mengen auf Einsätze gesetzt werden. (A) Einfügen auf der linken Seite 100 l, Mitte 150 l und rechts 200 l, direkt nach der Aussaat. Blasen in den Gelen waren noch vorhanden. (B) Einfügen auf der linken Seite 200 l, Mitte 150 l und rechts 100 l, nach 60 min Vernetzung. Alle Gele unabhängig von der Lautstärke erscheinen immer noch flach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig6.jpg"> Abbildung 6: Fibrinogen (200 l) in einem Konzentrationsbereich von 70 bis 1 mg/ml, der auf den Deckel einer 12-Well-Platte gesetzt wird. (A) Gele direkt nach der Aussaat. (B) Gele 20 min nach der Aussaat. (C) Gele über Nacht gehalten. Alle Gele erscheinen gut abgerundet, die 5 mg/ml und 1 mg/ml Gele wurden ausgeschlossen, da sie 20 min nach der Aussaat eine flüssigere Konsistenz zu haben schienen und begonnen hatten, sich vom Deckel zu lösen, nachdem sie über Nacht aufbewahrt worden waren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Kombination kollagen und Fibrinogen Basierend auf den Ergebnissen der Kollagen- und Fibrinogenkonzentrationwurde die Wirkung der Kombination von Kollagen und Fibrinogen bewertet. Drei Einsätze wurden mit dem folgenden, 4 mg/ml Kollagen, 20 mg/ml Fibrinogen und einer Ration von 1:1 Ration kollagen (4 mg/ml) und Fibrinogen (20 mg/ml) eingerichtet, siehe Abbildung 7. Unmittelbar nach der Aussaat der Hydrogele beobachteten wir, dass der Einsatz mit Kollagen allein noch ein flaches Aussehen in Kombination mit dem Auftreten von Blasen im Gel hatte. Die Einsätze mit Fibrinogen erzeugten ein vollständiges und abgerundetes Gel, ebenso wie der Einsatz mit der Kombination von Kollagen und Fibrinogen. Nach einer Kreuzverbindung bei 37 °C für 60 min hatten sich alle Gele am Einsatz befestigt und blieben nach einer nächtlichen Inkubation bei 37 °C befestigt.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig7.jpg"> Abbildung 7: Wirkung der Kombination von Kollagen und Fibrinogen. (A) Kollagen 4 mg/ml auf der linken Seite ausgesät, Fibrinogen 20 mg/ml auf Einsatz in der Mitte und Kollagen 4 mg/ml, Fibrinogen 20 mg/ml (1:1 Ration) auf der rechten Seite gesät. Alle Gele, die mit einem Volumen von 200 l mit 1,0 x 105 Zellen/ml gesät wurden, alle Gele waren 60 min bei 37 °C vernetzt. (B) Kollagen 4 mg/ml 60 min nach Vernetzung, Gel erschien flach und hatte Blasen. (C) Einfügen auf dem linken Fibrinogen 20 mg/ml, Gel erscheinen abgerundet, keine Blasen vorhanden, Einsatz auf dem rechten Kollagen 4 mg/ml, Fibrinogen 20 mg/ml Gel, Gel ist gut abgerundet ohne Blasen. (D) Kollagen 4 mg/ml Gel nach über Nacht bei 37 °C gehalten, Gel enthielt noch eine große Menge an Blasen, einige Schwellungen des Gels ist aufgetreten. (E) Fibrinogen 20 mg/ml über Nacht bei 37 °C gehalten. (F) Kollagen 4 mg/ml, Fibrinogen 20 mg/ml Gel über Nacht bei 37 °C gehalten. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig7large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Bestimmen der Zellsädichte Basierend auf den bisherigen Erfahrungen mit Hydrogelen wurde ein Experiment zur Bestimmung der optimalen Zellsädichte (daten nicht gezeigt)eingerichtet 37. Die Zellen wurden in eine Kombination von Kollagen und Fibrinogen im folgenden Konzentrationsbereich eingebettet (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1,0 x 106, 1,5 x 106 und 2,0 x 106 Zellen/ml), 2,0 x 106 Zellen/ml wurden als optimale Saatdichte gefunden.
Rheologie Zehn Formulierungen der Fibrinogen- und Kollagenhydrogelkombinationen wurden mittels Rheologie bewertet, siehe Tabelle 2. Ziel war es zu bestimmen, welche dieser Formulierungen die Lebersteifigkeit imitieren könnte, die während der Entwicklung von HCC beobachtet wurde. Literatur lieferte bekannte Lebersteifigkeitswerte für Ratten, Mäuse und Menschen während Fibrose, Zirrhose und HCC und das Ziel war es, so nah wie möglich an diese Werte zu kommen28,29,30,31,32. Die zehn Formulierungen gemäß Tabelle 2 wurden in Dreifachform erstellt, und der Speichermodul der einzelnen Formulierungen wurde mit einem Rheometer bestimmt, die Ergebnisse in Abbildung 8dargestellt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulierung</td>
			<td>Fibrinogen (mg/ml)</td>
			<td>Kollagen (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Kollagen- und Fibrinogenkombinationen in verschiedenen Konzentrationen, die mit Rheologie ausgewertet werden, um Steifigkeitswerte zu bestimmen
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig8.jpg"> Abbildung 8: Hydrogelsteifigkeitswerte für Kollagen- und Fibrinogenkombinationen in verschiedenen Konzentrationen, die mit Rheologie ausgewertet werden. Speichermodul und Verlustmodul wurden bei 37 °C und 1Hz mittels eines Discovery HR-2 Hybrid Rheometers (n = 3, Fehlerbalken = SD) ermittelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Aus diesen zehn Formeln wurden drei ausgewählt, um mit fortzufahren. Dazu gehörten 2 mg/ml Kollagen Typ I und 10 mg/ml Fibrinogen, die den Lebersteifigkeitswerten bei Beginn der Fibrose entsprachen, 2 mg/ml Kollagen Typ I und 30 mg/ml Fibrinogen entsprechend Zirrhose und 2 mg/ml Kollagen Typ I und 40 mg/ml Fibrinogen entsprechend HCC, siehe Abbildung 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig9.jpg"> Abbildung 9: Hydrogelsteifigkeitswerte für verschiedene Fibrinogen/Collagen Hydrogel-Formulierungen, die für die Fortsetzung ausgewählt wurden.  Speichermodul und Verlustmodul wurden bei 37 °C und 1 Hz bestimmt (n = 3, Fehlerbalken = SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Lebensfähigkeit, Arzneimittelreaktion und metastasierendes Potenzial Die Ergebnisse des AlamarBlue-Assays zeigten eine insgesamt reduzierte Zelllebensfähigkeit innerhalb der 2D-Kokultur, niedriger als erwartet, basierend auf den bekannten gemeldeten IC 25-, 50- und 75-Werten, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle siehe Abbildung 10. Dies kann auf die LX2-Zellen in unserer Co-Kultur zurückgeführt werden, die empfindlicher auf Doxorubicin-Behandlung sind. In unserem 3D-Modell haben wir jedoch die Doxorubicin-Resistenz festgestellt und erhöht, was die Abnahme des chemotherapeutischen Potenzials bestätigt, das häufig in 3D-Modellsystemen beobachtet wird. Die statistische Signifikanz im Vergleich zu den Kontrollen wurde mit dem Student-T-Test (zweischwanzend) bewertet, wobei P<0,05 als signifikant angesehen wurde.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig10.jpg"> Abbildung 10: Prozentuale Zelllebensfähigkeit eines 2D-Kokulturmodells im Vergleich zum 3D-Modell nach behandlung mit Doxorubicin in verschiedenen Konzentrationen für einen Zeitraum von 72h. Die Ergebnisse normalisiert relativ zum unbehandelten Steuerelement (n=3, Fehlerbalken = SD) (* = p<0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Gelkonstrukte wurden täglich mit einem Lichtmikroskop visuell untersucht, um das Zellwachstum in verschiedenen Konzentrationen der Hydrogele zu verfolgen. Zellen füllten die Hydrogele homogen und kompakt, ab Tag 7 begannen Sphäroide innerhalb der Matrix zu montieren.

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A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Dieses Protokoll stellt ein biomimetisches 3D-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach dar. Hergestellt mit physiologisch relevanten Hydrogelen in Verhältnissen, die die biophysikalischen Eigenschaften der stromalen extrazellulären Matrix imitieren, ein aktiver Mediator von zellulären Wechselwirkungen, Tumorwachstum und Metastasierung.

Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.1K Aufrufe.  Uppsala University. Dieses Protokoll stellt ein biomimetisches 3D-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach dar. Hergestellt mit physiologisch relevanten Hydrogelen in Verhältnissen, die die biophysikalischen Eigenschaften der stromalen extrazellulären Matrix imitieren, ein aktiver Mediator von zellulären Wechselwirkungen, Tumorwachstum und Metastasierung.

Serie: A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Forschung

Krebsforschung

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Development and Angiographic Use of the Rabbit VX2 Model for Liver Cancer

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of Interventional Radiology. This model employs an anaplastic squamous cell carcinoma that is easily and reliably propagated in the skeletal muscle of donor rabbits for eventual harvest and allograft implantation into the liver of na&#239;ve recipients. This tumor graft rapidly grows within the liver of recipient rabbits into an angiographically identifiable tumor characterized by a necrotic core surrounded by a viable hypervascular capsule. The physical size of the rabbit anatomy is sufficient to facilitate vascular instrumentation allowing for the application and testing of various interventional techniques. Despite these benefits, there exists a paucity of technical resources to act as a concrete reference for researchers working with the model. Herein, we present a comprehensive visual outline for the technical aspects of development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 tumor model for use by novice and experienced researchers alike.

The goal of this article is to provide a primer for the development and use of the VX2 carcinoma rabbit model for liver cancer.

Entwicklung und angiographischen Umgang mit dem Kaninchen VX2 Modell für Leberkrebs

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, depending on the cancer type. To reduce the brain metastatic tumor burden, gaps in basic and translational knowledge need to be addressed. Major challenges include a paucity of reproducible preclinical models and associated tools. Three-dimensional models of brain metastasis can yield the relevant molecular and phenotypic data used to address these needs when combined with dedicated analysis tools. Moreover, compared to murine models, organ-on-a-chip models of patient tumor cells traversing the blood brain barrier into the brain microenvironment generate results rapidly and are more interpretable with quantitative methods, thus amenable to high throughput testing. Here we describe and demonstrate the use of a novel 3D microfluidic blood brain niche (&#181;mBBN) platform where multiple elements of the niche can be cultured for an extended period (several days), fluorescently imaged by confocal microscopy, and the images reconstructed using an innovative confocal tomography technique; all aimed to understand the development of micro-metastasis and changes to the tumor micro-environment (TME) in a repeatable and quantitative manner. We demonstrate how to fabricate, seed, image, and analyze the cancer cells and TME cellular and humoral components, using this platform. Moreover, we show how artificial intelligence (AI) is used to identify the intrinsic phenotypic differences of cancer cells that are capable of transit through a model &#181;mBBN and to assign them an objective index of brain metastatic potential. The data sets generated by this method can be used to answer basic and translational questions about metastasis, the efficacy of therapeutic strategies, and the role of the TME in both.

Here, we present a protocol for preparing and culturing a blood brain barrier metastatic tumor micro-environment and then quantifying its state using confocal imaging and artificial intelligence (machine learning).

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie