Os autores gostariam de agradecer a todo o consórcio ACEnano por discussões frutíferas ao longo de todas as etapas da elaboração do protocolo aqui apresentado. Os autores também apreciam o financiamento do Programa Horizonte 2020 da União Europeia (H2020) sob o contrato de subvenção nº 720952 no âmbito do projeto ACEnano.

1. Configuração do sistema AF4
<ol><li>Monte o cartucho AF4 e conecte todos os componentes de hardware do sistema AF4 e do detector UV-vis(Tabela de Materiais)seguindo as instruções dadas no manual do fabricante.</li>
	<li>Instale todos os pacotes de software necessários para controle, aquisição de dados, processamento e avaliação seguindo as instruções fornecidas no manual do fabricante.</li>
	<li>Certifique-se de que todas as conexões de sinal necessárias entre o sistema AF4 e o detector UV-vis foram estabelecidas.</li>
	<li>Certifique-se de que as conexões AF4-UV-vis estabelecidas são apertadas e sem vazamentos, lavando a configuração com água ultrauso (UPW) por 15 min (taxa de fluxo de ponta 1 mL∙min-1, taxa de fluxo de foco 1 mL∙min-1, e taxa de fluxo cruzado de 1,5 mL∙min-1). Para isso, abra o software de controle AF4 e insira as taxas de fluxo nos respectivos painéis no lado superior direito da página de pouso. Aperte os respectivos conectores (encaixes), se necessário, e repita o procedimento até que não haja vazamentos observáveis. NOTA: A pressão interna do sistema durante todas as medições deve ser monitorada e deve estar dentro de 4 a 12 barras. Caso a pressão seja maior ou menor, a tubulação de pressão traseira precisa ser ajustada. Além disso, a tendência de pressão do canal deve ser constante durante o tempo completo de medição. NOTA: Se um forno de canal estiver disponível, defina sua temperatura para 25 °C para garantir condições de medição comparáveis em todos os experimentos AF4.</li>
</ol>2. Elaboração de soluções e suspensões para qualificação do sistema AF4-UV-vis e análise de amostras
<ol><li>Solução de limpeza<ol>
<li>Adicione 8 g de hidróxido de sódio sólido (NaOH) e 2 g de sulfato de dodecim de sódio (SDS) a 1 L de UPW e mexa a solução até a dissolução total.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluente<ol>
<li>Adicione 500 μL de mistura de surfactante filtrada a 2 L de UPW filtrada e desgaseada para obter o eluente (0,025% (v/v), pH em torno de 9,4). NOTA: Uma descrição detalhada dos compostos da mistura surfactante é dada na Tabela 1 (também Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Padrão de tamanho AuNP arbitrário para determinação de recuperação em massa<ol>
<li>Vórtice um padrão de tamanho AuNP arbitrário (50 mg∙L-1) por 2 min e diluí-lo 1:4 com UPW para obter uma concentração de massa final de 12,5 mg∙L-1. Vórtice por mais 2 minutos após a diluição para homogeneizar a suspensão obtida. ATENÇÃO: São necessárias medidas de precaução necessárias e equipamentos de proteção adequados ao trabalhar com produtos químicos, especialmente pelotas NaOH. NOTA: É geralmente recomendado desaparar e filtrar todas as soluções necessárias (exceto a solução de limpeza) usando um filtro de membrana de 0,1 μm (PVDF hidrofílico ou similar) para garantir baixos fundos de partículas durante os experimentos AF4-UV-vis. Isso pode ser estabelecido por uma unidade de filtragem de vácuo dedicada ou usando filtros de seringa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Qualificação do sistema AF4-UV-vis
<ol><li>Use as configurações de software descritas na etapa 1.4 para lavar o sistema com a solução de limpeza por 30 minutos (Taxa de fluxo de ponta 1 mL∙min-1, taxa de fluxo focus 1 mL∙min-1, e taxa de fluxo Cross 1,5 mL∙min-1).</li>
	<li>Altere a respectiva garrafa eluente e lave o sistema com UPW por 20 min (Taxa de fluxo de ponta 1 mL∙min-1, Taxa de fluxo Focus 1 mL∙min-1, e fluxo Cross 1,5 mL∙min-1).</li>
	<li>Substitua os respectivos filtros de bomba inline.</li>
	<li>Abra o cartucho AF4 e substitua a membrana AF4. Remonte o cartucho AF4 e reconecte-o com o sistema AF4-UV-vis.</li>
	<li>Lave o sistema AF4-UV-vis limpo com o eluente por pelo menos 30 minutos, a fim de equilibrar a membrana e estabilizar o sistema (Taxa de fluxo de ponta 1 mL∙min-1, taxa de fluxo focus 1 mL∙min-1, e fluxo cruzado de 1,5 mL∙min-1). Verifique se há possíveis vazamentos novamente (ver passo 1.4).</li>
	<li>Qualifique o sistema AF4-UV-vis determinando a recuperação em massa e a variação do tempo de retenção usando um padrão de tamanho AuNP arbitrário.<ol>
<li>Realize uma execução de injeção direta sem a aplicação de uma força de separação.<ol>
<li>Crie um novo arquivo de medição abrindo o Arquivo | Nova | Execute no software de controle AF4.</li>
			<li>Defina a descrição da amostra e da medição, bem como o volume de injeção e o nome da amostra na guia Executar. As condições de medição são exibidas na Tabela 2.</li>
			<li>Defina os parâmetros de medição no método FFF da segunda aba de acordo com a Tabela 2.</li>
			<li>Clique no botão Executar para iniciar a medição.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realize uma execução fracionada com a aplicação de uma força de separação (fluxo cruzado).<ol>
<li>Defina o método de fracionamento descrito na seção anterior utilizando as condições de fracionamento especificadas na Tabela 3.</li>
			<li>Clique no botão Executar para iniciar a medição.</li>
			<li>Realize a medição em quadruplicação. NOTA: A primeira execução visa condicionar o sistema (ou seja, a membrana AF4) e será excluída da avaliação final dos resultados de qualificação do sistema. NOTA: Recomenda-se salvar todos os arquivos gerados abrindo | de arquivos Salve no software de controle AF4.</li>
			<li>Considere o sistema AF4-UV-vis qualificado se uma recuperação em massa de >80% e uma variação do tempo de retenção <2% for obtida para o padrão de tamanho AuNP arbitrário.</li>
			<li>Ao usar um autosampler como sistema de injeção, encha o frasco do reservatório de lavagem de agulhas do autosampler com a mesma solução que é bombeada através do sistema AF4-UV-vis (por exemplo, solução de limpeza, UPW ou respectivo eluente) para garantir condições ideais de execução. Ao alterar o eluente, é geralmente recomendável seguir o reevolumento do sistema AF4 monitorando o sinal do detector UV-vis até que sua linha de base permaneça estável em um nível constante.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ANÁLISE AMOSTRA AF4-UV-vis
<ol><li>Prepare todos os padrões de tamanho AuNP para calibração de tamanho externo, vórtice da respectiva suspensão AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, cada 50 mgs. L-1) por 2 min e diluí-lo 1:4 com UPW para obter uma concentração de massa final de 12,5 mg∙L-1. Vórtice por mais 2 minutos após a diluição para homogeneizar as suspensões obtidas.</li>
	<li>Prepare a amostra AuNP desconhecida para análise aplicando o mesmo procedimento das normas de calibração descritas na etapa 4.1.</li>
	<li>Realize uma medição de injeção direta de todos os padrões de tamanho AuNP usando o método AF4 exibido na Tabela 2.<ol>
<li>Para isso, insira os respectivos valores resumidos na Tabela 2 no software do fabricante nas posições apropriadas para definir os parâmetros de separação e amostra e pressione o botão Executar para iniciar o experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fracionar cada padrão de tamanho AuNP individualmente usando o método AF4 exibido na Tabela 3 para estabelecer a função de calibração de tamanho externo.<ol>
<li>Digite os respectivos valores resumidos na Tabela 3 no software do fabricante nas posições apropriadas. O método de fracionamento é definido por uma etapa de focalização, várias etapas de elução e uma etapa de lavagem. Depois de configurar o método, pressione o botão Executar para iniciar o experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize uma medição de injeção direta da amostra AuNP desconhecida usando o método AF4 exibido na Tabela 2.</li>
	<li>Realize o fracionamento da amostra AuNP desconhecida realizando o método AF4 listado na Tabela 3.</li>
	<li>Realizar todas as medições mencionadas nas Seções 3 e 4 em triplicado, a menos que seja declarado de outra forma para garantir resultados significativos e estatisticamente relevantes.<ol>
<li>Armazene 50 mg∙L-1 Suspensões de estoque AuNP a 4-8 °C antes de usar. As suspensões AuNP diluídas são preparadas idealmente dentro de 30 minutos antes da aplicação. NOTA: O vórtice é geralmente suficiente e não é necessária ultrassônica das suspensões.</li>
		<li>A fim de permitir uma correlação do tempo de retenção da amostra AuNP desconhecida com os tempos de retenção obtidos para os padrões de tamanho AuNP, meça todas as amostras usando o mesmo método AF4. NOTA: Para assegurar condições de separação constantes e válidas, inclua/repita a etapa de fracionamento descrita na seção de qualificação do sistema (ver etapa 3.6.2) após um número definido de medidas amostrais (por exemplo, 10 medidas). Além disso, registra a pressão do sistema e a estabilidade da linha de base do detector UV-vis. Eles devem permanecer estáveis e constantes ao longo de uma corrida COMPLETA AF4-UV-vis. NOTA: Normalmente, substitua a membrana de ultrafiltração quando o detector UV-vis (ou detector de dispersão de luz multi ângulo (MALS), se disponível) mostrar um nível de ruído aumentado ou os critérios de qualificação do sistema definidos, como recuperação, forma de pico da amostra ou capacidade de repetição, foram submetidos a um procedimento de limpeza completo). Nas condições aqui descritas, o sistema AF4-UV-vis qualificado é geralmente estável para pelo menos 50 medições usando a mesma membrana; no entanto, o número de possíveis medidas consecutivas atendendo aos critérios de qualidade definidos pode variar significativamente dependendo da amostra, matriz amostral e composição eluente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Avaliação de dados
<ol><li>Realize o cálculo de recuperação em massa utilizando o software de avaliação de dados fornecido pelo fabricante do sistema AF4-UV-vis ou análise de planilha após a exportação de todos os dados brutos necessários (ou seja, área de pico UV-vis) do respectivo software de aquisição de dados seguindo as instruções dadas no manual do fabricante.<ol>
<li>Calcule a recuperação de massa AuNP comparando as áreas sob os respectivos picos UV-vis da medição de fracionamento (Afracionamento) e a medição de injeção direta (Umainjeção direta)usando a seguinte equação: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> NOTA: Durante uma medição de injeção direta, nenhuma força de separação é aplicada e, portanto, interações potenciais de uma espécie analito com a parede de acumulação podem ser negligenciadas. A área sob um respectivo pico UV-vis pode ser diretamente correlacionada com a massa AuNP usando a lei Beer-Lambert assumindo que nenhuma outra espécie dentro da amostra absorve no respectivo comprimento de onda e/ou i) elutes em outro tempo de retenção sob condições de fracionamento ii) é removida através da membrana AF4.</li>
		<li>Importar os arquivos dat. obtidos tanto da injeção direta quanto do fracionamento executado.</li>
		<li>Selecione o traço do detector UV-vis na guia Visão geral.</li>
		<li>Defina uma Região de Interesse (ROI) e uma linha de base no sinal e na visão da linha de base para todas as medições.</li>
		<li>Insira uma calibração de injeção direta via Insert.</li>
		<li>Selecione todas as correções de injeção direta na exibição de configurações de calibração de injeção direta e digite um coeficiente de extinção UV. NOTA: É importante utilizar o mesmo coeficiente de extinção UV-vis tanto para a calibração quanto para a medição do fracionamento.</li>
		<li>Estabeleça a linha de calibração utilizando a área sob o traço de sinal UV-vis dentro do ROI e a quantidade injetada calculada a partir da concentração inserida e do volume de injeção. A calibração obtida será mostrada na janela separada da função de calibração da injeção direta.</li>
		<li>Atribua a função de calibração às respectivas medidas de fracionamento. NOTA: Para cada padrão de tamanho de calibração e a amostra AuNP desconhecida, uma função de calibração separada precisa ser estabelecida devido à absorção UV-vis dependente do tamanho do AuNP. Esta desvantagem do detector UV-vis pode ser contornada usando um detector sensível à massa, como um ICP-MS.</li>
		<li>Realize as análises inserindo um cálculo de Resultados Quantitativos e os resultados serão exibidos dentro de uma tabela à direita como valores de concentração e valores injetados.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule a variação do tempo de retenção utilizando o software de avaliação de dados fornecido pelo fabricante do sistema AF4 ou análise de planilha após a exportação de todos os dados brutos necessários (ou seja, tempos de retenção dos padrões de calibração AuNP no respectivo pico UV-vis maxima e respectivos tempos de vazio) a partir do respectivo software de aquisição de dados seguindo as instruções dadas no manual do fabricante.<ol>
<li>Abra a janela Visão Geral para exibir os respectivos traços UV para todas as medidas importadas.</li>
		<li>A detecção de pico será realizada automaticamente; ajustar os parâmetros de detecção de pico dentro da caixa de ferramentas de processamento de sinal para otimizar o desempenho. Extrair o respectivo pico máximo através de todos os arquivos de medição.</li>
		<li>Calcule o desvio padrão relativo para todas as medidas usando a seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> O cálculo também pode ser realizado utilizando um respectivo software de planilha.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute a determinação de tamanho utilizando o software de avaliação de dados fornecido pelo fabricante ou análise de planilha após a exportação de todos os dados brutos necessários (tempo de retenção no pico máximo de analito e respectivo tempo de vazio) do respectivo software de aquisição de dados seguindo as instruções dadas no manual do fabricante. Uma função de calibração de tamanho externo pode ser estabelecida plotando os tempos de retenção corrigidos pelo tempo de vazio (tempos de retenção líquida, ver Tabela 5) dos padrões de tamanho AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) contra seus tamanhos hidrodinâmicos obtidos a partir de medições DLS previamente realizadas (ver Tabela 4). NOTA: As medidas de DLS devem ser realizadas idealmente no mesmo dia das respectivas medidas de fracionamento para garantir propriedades amostrais comparáveis.<ol>
<li>Depois de importar os arquivos .dat todas as medidas são exibidas na guia Visão geral. Selecione o sinal do detector UV-vis da lista de detectores, que é exibido abaixo da janela de sobreposição. Defina um ROI e uma linha de base para cada medição, que pode ser ajustado na exibição sinal e linha de base. Use a caixa de ferramentas de processamento de sinal à direita para suavizar sinais barulhentos. Use os Parâmetros de Processamento de Atribuição para outras funções de Execuções para permitir que os parâmetros sejam alocados em outras medições, respectivamente sinais.</li>
		<li>Selecione a calibração do tamanho da partícula na guia Inserir.</li>
		<li>Selecione todas as corridas de calibração clicando na respectiva medição na tabela Selecionar referências para calibração no lado superior direito. Todas as medidas selecionadas serão exibidas em uma tabela abaixo. Digite o raio hidrodinâmico para todas as medidas de calibração especificadas na Tabela 4. A função será exibida na calibração do tamanho das partículas – Janela de função e a equação também serão mostradas. NOTA: O coeficiente de correlação (R2) da função de calibração de tamanho estabelecida deve ser ≥0.990.</li>
		<li>Atribua a função de calibração às medidas da amostra AuNP desconhecida, selecionando os respectivos fracionamentos dentro da lista Select Runs for Assignment.</li>
		<li>Mostre os resultados abrindo um cálculo de distribuição de tamanho de partícula dentro da guia de inserção. A calibração do tamanho da partícula previamente criada será listada como calibração para as medições de amostra AuNP desconhecidas, que é exibida nas configuraçõesda janela direita . O tamanho calculado será mostrado na janela de distribuição de tamanho rotulada ao máximo de pico. Selecione a caixa de seleção de sinais médios para amostra para mediar todas as medidas de uma amostra e liste o resultado no rótulo máximo de pico.</li>
		<li>Além disso, plote a linha de calibração sobre o fractograma selecionando a caixa de seleção da curva de calibração Show. Uma distribuição de tamanho cumulativo está disponível selecionando a caixa de seleção de distribuição cumulativa Show. NOTA: Ao usar o software do fabricante para avaliação de dados, recomenda-se adicionar todos os resultados a um relatório, que pode ser gerado clicando em Relatório dentro da guia Inserir. O botão Relatório adiciona todos os resultados, tabelas e diagramas a um documento. Na guia Relatório, as configurações do relatório podem ser alteradas abrindo a configuração do relatório na seção Documento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Todos os autores deste manuscrito são funcionários da Postnova Analytics GmbH, cujos produtos são utilizados neste protocolo.

O tamanho hidrodinâmico de um AuNP desconhecido foi avaliado com precisão pelo AF4 juntamente com um detector UV-vis usando padrões de tamanho AuNP bem definidos que variam de 20 nm a 100 nm. O método AF4 desenvolvido foi otimizado utilizando um perfil de fluxo cruzado constante para estabelecer uma relação linear entre o tempo de retenção medido e o tamanho do AuNP, permitindo assim uma determinação de tamanho simples a partir da análise de regressão linear. O foco particular também foi alcançar taxas de recuperação suficientemente altas indicando nenhuma perda amostral significativa durante o fracionamento, e que o método AF4 desenvolvido, incluindo o eluente aplicado e a membrana, combinavam bem com todas as amostras de AuNP fracionadas.
O desenvolvimento do método é, sem dúvida, o passo mais crítico no AF4 e vários parâmetros, incluindo dimensões do canal, parâmetros de fluxo, bem como eluente, membrana, altura espaçadora e até propriedades amostrais devem ser levados em conta para melhorar o fracionamento dentro de uma determinada janela de tempo de eluição. O objetivo deste parágrafo é orientar o leitor através das etapas críticas que foram otimizadas para determinar com sucesso o tamanho da amostra AuNP desconhecida aqui discutida. Para uma descrição mais detalhada de como desenvolver geralmente um método AF4, o leitor é encaminhado para a seção AF4 de 'ISO/TS21362:2018 - Nanotecnologias - Análise de nanoí objetos usando fluxo assimétrico e fracionamento de fluxo de campo centrífuga'25. Tendo um olhar mais atento sobre as condições de fracionamento aplicadas dadas na Tabela 3,o primeiro passo crítico é a introdução e relaxamento da amostra AuNP no canal AF4. Esta etapa é regida pelo fluxo de injeção, fluxo de foco e fluxo cruzado, cuja interação força a amostra a localizar perto da superfície da membrana e co concentrar-a em uma faixa estreita perto da porta de injeção do canal AF4 basicamente definindo o ponto de partida do fracionamento. Um relaxamento suficiente da amostra é obrigatório, pois durante esta etapa, constituintes amostrais de diferentes tamanhos se localizam em diferentes alturas do canal AF4, fornecendo assim a base para um fracionamento de tamanho bem sucedido. O relaxamento incompleto da amostra é geralmente visível por uma área de pico de vazio aumentada resultante de constituintes de amostra não contidos (ou seja, não relaxados). Esse efeito pode ser mitigado aumentando o tempo de injeção e/ou a taxa de fluxo cruzado aplicada. No entanto, ambos os parâmetros precisam de uma otimização cuidadosa, especialmente para amostras que são propensas à aglomeração e adsorção na membrana AF4, e podem ser monitoradas pelas respectivas taxas de recuperação obtidas para diferentes configurações de parâmetros36,37. O tempo de injeção aplicado de 5 minutos juntamente com uma taxa de fluxo cruzado de 1,0 mL∙min-1 revelou taxas de recuperação >80% para todas as amostras de AuNP e uma área de pico de vazio insignificante indicando condições de relaxamento quase ótimas. Após relaxamento suficiente da amostra AuNP, o fluxo de foco foi interrompido e o transporte amostral ao longo do comprimento do canal AF4 para o respectivo detector UV-vis foi iniciado representando o segundo passo crítico. A fim de garantir um poder de fracionamento suficientemente alto em tempos de análise razoáveis, uma taxa de fluxo cruzado constante de 1,0 mL∙min-1 para 30-50 min (dependendo do respectivo padrão de tamanho AuNP fracionado) seguida de uma decadência de fluxo cruzado linear de 10 minutos a uma taxa de fluxo detector de 0,5 mL.min-1 foi aplicada. O uso de um perfil de fluxo cruzado constante através da separação de todos os padrões de tamanho AuNP revelou uma relação linear entre o tempo de retenção e o tamanho de AuNP após a teoria do FFF22,permitindo assim a determinação de tamanho da amostra AuNP desconhecida por simples análise de regressão linear. No entanto, perfis diferentes de um fluxo cruzado constante também foram explorados para o dimensionamento de nanopartículas, levando, em última análise, a uma relação não linear entre o tempo de retenção e o tamanho das partículas38,39. Além disso, a determinação de tamanho no AF4 utilizando padrões de tamanho bem definidos não se limita ao AuNP, mas também pode ser aplicada a nanopartículas com outros tamanhos e composição elementar (por exemplo, prata38,40 ou nanopartículas de sílica41,42). Além disso, ao trabalhar com amostras diluídas, o ICP-MS é um detector elementar altamente sensível, que pode ser acoplado ao AF4, aumentando a versatilidade desta abordagem analítica para dimensionamento de uma grande variedade de nanopartículas em suspensão.
Apesar de sua aplicação generalizada, a calibração de tamanho externo usando padrões de tamanho bem definidos no AF4 tem algumas peculiaridades que precisam ser consideradas ao usá-la para um dimensionamento preciso de amostras desconhecidas. Em primeiro lugar, depende fortemente da aplicação de condições comparáveis durante o fracionamento dos respectivos padrões de tamanho e da amostra real. No caso aqui apresentado, é, portanto, obrigatório que tanto as normas de tamanho AuNP quanto a amostra AuNP desconhecida sejam fracionadas usando o mesmo método AF4, bem como o mesmo eluente e a mesma membrana tornando esta abordagem bastante inflexível. Além disso, sem detectores sensíveis ao tamanho, por exemplo, dispersão de luz (MALS e DLS) em mãos, é difícil determinar se um método AF4 respectivo usando padrões de tamanho funciona suficientemente bem ou não. Isso vale especialmente para amostras desconhecidas que exibem distribuições de tamanho muito amplo, onde ainda não está claro se todos os constituintes da amostra seguem o padrão de elução normal: fracionamento de partículas menores para maiores, ou se constituintes de amostra maior já eluto no modo esterico-hipercamada, potencialmente co-eluindo com componentes amostrais menores43,44. Além disso, embora a teoria da FFF enfatize que o AF4 se separa apenas com base em diferenças no tamanho hidrodinâmico com partículas sendo consideradas massas de ponto sem qualquer interação com seu ambiente22, a realidade conta uma história diferente com partícula-partícula e partícula interações de membrana (como atração eletrostática/repulsão ou atração van-der-Waals) podem desempenhar um papel considerável e podem potencialmente introduzir um viés mensurável nas determinações de tamanho via calibração de tamanho externo45,46. Recomenda-se, portanto, usar padrões de tamanho que correspondam idealmente à composição e às propriedades superficiais (potencial Zeta) da partícula de interesse40,42 ou, se estes não estiverem disponíveis, pelo menos utilize padrões bem caracterizados de tamanho de partículas (por exemplo, partículas de látex de poliestireno) e avalie cuidadosamente sua comparabilidade com a partícula de interesse especialmente em termos de seu potencial zeta superficial no respectivo ambiente, no qual a análise deve ser realizada41,47.
A versatilidade do AF4 é muitas vezes considerada sua maior força, pois oferece uma gama de aplicações que vai além da maioria das outras técnicas de dimensionamento comum neste campo22,48,49. Ao mesmo tempo, devido à sua complexidade presumivelmente associada, também pode ser considerada como sua desvantagem mais significativa especialmente contra técnicas de dimensionamento rápidas e ostensivamente fáceis de usar, como DLS, Nanoparticle Tracking Analysis ou ICP-MS de partículas únicas. No entanto, ao colocar o AF4 em perspectiva com essas técnicas populares de dimensionamento, torna-se claro que todas as técnicas têm seus prós e contras, mas todas elas contribuem para uma compreensão mais abrangente da natureza físico-química das nanopartículas e, portanto, devem ser consideradas complementares e não competitivas.
O procedimento operacional padrão (SOP) apresentado aqui, destaca a excelente aplicabilidade do AF4-UV-vis com calibração de tamanho externo para dimensionamento de uma amostra AuNP desconhecida em suspensão e eventualmente foi aplicada como uma diretriz recomendada para a análise AF4 de uma amostra AuNP desconhecida dentro de uma comparação interlaboratória internacional (ILC) que foi conduzida no quadro do projeto Horizon 2020, ACEnano (o resultado deste ILC será o tema de uma futura publicação). Este protocolo, portanto, soma-se aos esforços internacionais encorajadores e contínuos para validar e padronizar as metodologias AF425,50,51,52 sublinhando o potencial promissor do AF4 no campo da caracterização das nanopartículas.

As nanopartículas de ouro (AuNP) na forma de ouro coloidal tinham sido parte da cultura humana muito antes de haver uma compreensão do que eram as nanopartículas e antes do termo nanopartícula ter encontrado seu caminho para o vocabulário científico contemporâneo. Sem conhecimento distinto de sua aparência nanoescala, a AuNP suspensa já havia sido usada para fins médicos e outros na China antiga, Arábia e Índia nos séculos V-VI a.C.1, e também os antigos romanos aproveitaram sua cor vermelha rubi para manchar famosamente sua cerâmica na exposição da Copa Lycurgus no Museu Britânico2. No mundo ocidental, ao longo dos séculos, da Idade Média à Era Moderna, o AuNP suspenso foi predominantemente usado como agentes de coloração para vidro e esmalte (Roxo de Cássio)3, bem como para tratar uma variedade de doenças (Ouro Potável), especialmente sífilis4.
No entanto, todos esses estudos tinham focado principalmente na aplicação da AuNP suspensa e cabeu a Michael Faraday em 1857 introduzir a primeira abordagem racional para investigar sua formação, sua natureza, bem como suas propriedades5. Embora Faraday já estivesse ciente de que esses AuNP devem ter dimensões muito minuciosas, não foi até o desenvolvimento de microscopia eletrônica quando informações explícitas sobre sua distribuição de tamanho estavam acessíveis6,7, eventualmente permitindo a correlação entre tamanho e outras propriedades AuNP.
Hoje em dia, graças à sua síntese bastante fácil e simples, propriedades ópticas notáveis (ressonância de plasmon superficial), boa estabilidade química e, portanto, menor toxicidade, bem como sua alta versatilidade em termos de tamanhos disponíveis e modificações de superfície, a AuNP encontrou aplicações generalizadas em campos como nanoeletrônica8, diagnóstico9,terapia oncológica10, ou entrega de medicamentos11. Obviamente, para essas aplicações, o conhecimento preciso do tamanho e da distribuição de tamanho do AuNP aplicado é um pré-requisito fundamental para garantir a eficácia ideal12 e há uma demanda substancial por ferramentas robustas e confiáveis para determinar este parâmetro físico-químico crucial. Hoje, há uma infinidade de técnicas analíticas capazes de dimensionar AuNP em suspensão, incluindo, por exemplo, Espectroscopia de massa de plasma UV-vis (UV-vis)13, Dispersão dinâmica de luz (DLS)14 ou Espectrometria de Massa de Plasma Indutivamente Acoplada (spICP-MS)15 com Fracionamento de Fluxo de Campo (FFF) sendo um jogador-chave neste campo16,17,18,19,20.
Primeira conceitualizada em 1966 por J. Calvin Giddings21, FFF compreende uma família de técnicas de fracionamento baseadas em eluição, onde a separação ocorre dentro de um canal fino, semelhante a uma fita, sem uma fase estacionária22,23. Em FFF, a separação é induzida pela interação de uma amostra com um campo de força externa que age perpendicularmente à direção de um fluxo de canal laminar, no qual a amostra é transportada rio abaixo geralmente para respectivos detectores in-line. Entre essas técnicas relacionadas fff, O Fracionamento de Fluxo de Fluxo Assimétrico (AF4), onde um segundo fluxo (fluxo cruzado) atua como campo de força, tornou-se o subtipo24mais utilizado . No AF4, a parte inferior do canal (parede de acumulação) é equipada com uma membrana de ultrafiltração semipermeável que é capaz de reter a amostra, permitindo simultaneamente que o fluxo cruzado passe pela membrana e deixe o canal através de uma saída extra. Por isso, o fluxo cruzado pode empurrar a amostra para a parede de acumulação, contrariando assim seu fluxo induzido por difusão (movimento browniano). Em um equilíbrio resultante de fluxos induzidos por campo e difusão; Constituintes de amostra menores que apresentam maiores coeficientes de difusão se alinham mais perto do centro do canal, enquanto constituintes de amostra maior que exibem coeficientes de difusão mais baixos se localizam mais perto da parede de acumulação. Devido ao perfil de fluxo parabólico dentro do canal, os componentes amostrais menores são, portanto, transportados na laminae mais rápida do fluxo do canal e elute antes de constituintes maiores da amostra. Usando o parâmetro de retenção de FFF e as equações do coeficiente de difusão de Stokes-Einstein, o tempo de eluição e, respectivamente, o volume de eluição, de uma amostra em AF4 podem então ser traduzidos diretamente para o seu tamanho hidrodinâmico22. Aqui, o comportamento de elução descrito refere-se ao modo de elução normal e geralmente é válido para AF4 dentro de uma faixa de tamanho de partícula entre aproximadamente 1-500 nm (às vezes até 2000 nm, dependendo das propriedades de partículas e parâmetros de fracionamento), enquanto a eluição esterica-hipercamada geralmente ocorre acima deste limite de tamanho25.
Existem três maneiras comuns de obter informações de tamanho após a separação por FFF. Uma vez que o FFF é um instrumento modular, ele pode ser combinado a jusante com vários detectores, como detectores de dispersão de luz sensíveis ao tamanho com base no princípio da Dispersão de Luz Multi-Ângulo (MALS)26,27, Dispersão dinâmica de luz (DLS)28,29, ou até mesmo uma combinação de ambos para obter informações adicionais de forma30,31. No entanto, uma vez que o comportamento de retenção de uma amostra em um canal FFF é geralmente regido por forças físicas bem definidas, o tamanho também pode ser calculado usando uma abordagem matemática (teoria FFF), onde um simples detector de concentração (por exemplo, um detector UV-vis) é suficiente para indicar a presença de uma amostra de elutração32,33.
Como terceira opção, informamos aqui a aplicação de uma calibração de tamanho externo34,35 usando padrões AuNP bem definidos na faixa de tamanho de 20-100 nm para dimensionamento de uma amostra de nanopartículas de ouro desconhecida na suspensão usando AF4 juntamente com a detecção UV-vis. Esta simples configuração experimental foi escolhida de propósito para permitir que o maior número possível de laboratórios se juntasse a uma comparação interlaboratória internacional (ILC), que mais tarde foi realizada no quadro do projeto ACEnano da União Europeia 2020 com base no protocolo aqui apresentado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-FIL-TEF-002</td>
			<td>Used for filtration of aqueous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Durapore Millex</td>
			<td>Used for filtration of NovaChem100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Research Plus</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 cartridge</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ENTRIS124I-1S</td>
			<td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN5300</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel Oven</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN4020</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossflow Module</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF Control Module</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>ep T.I.P.S</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>1-0199</td>
			<td>Used for eluent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1131</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>VIA-002</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaCal Gold</td>
			<td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VIBRAX-VXR</td>
			<td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer (PC)</td>
			<td>Dell Technologies</td>
			<td>/</td>
			<td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>In accordance with respective laboratory&#8217;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-VIA-09150868</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &#8805;99 %, Blotting Grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>2326.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &#8805;98 %, p.a</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Control and Data Acquisition</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaFFF AF2000 Software</td>
			<td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Data Evaluation</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaAnalysis Software</td>
			<td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for final Data Processing</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Origin 2019</td>
			<td>Used for final data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Degasser</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7520</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Selector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7310</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Organizer</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7140</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant Mixture</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaChem100</td>
			<td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1130</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unknown AuNP sample</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC60</td>
			<td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis Detector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN3211</td>
			<td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Eluent Filtration System</td>
			<td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Milli-Q Integral 5</td>
			<td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&#937;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

O tamanho das partículas é, sem dúvida, o parâmetro físico-químico mais importante associado à noção de uma nanopartícula. O conhecimento preciso do tamanho e tamanho da distribuição das nanopartículas é de extrema importância para várias aplicações. A faixa de tamanho também é importante, pois define o componente mais "ativo" de uma dose de nanopartícula.
O Fracionamento de Fluxo de Fluxo Assimétrico (AF4) é uma técnica poderosa para dimensionamento de partículas em suspensão na faixa de tamanho de aproximadamente 1-1000 nm. Existem várias maneiras de obter informações de tamanho de um experimento AF4. Além de acoplar o AF4 on-line com detectores sensíveis ao tamanho com base nos princípios de Dispersão de Luz Multi-Ângulo ou Dispersão Dinâmica de Luz, há também a possibilidade de correlacionar o tamanho de uma amostra com seu tempo de retenção usando uma abordagem teórica bem estabelecida (teoria FFF) ou comparando-a com os tempos de retenção de padrões de tamanho de partículas bem definidos (calibração de tamanho externo).
Descrevemos aqui o desenvolvimento e validação interna de um procedimento operacional padrão (SOP) para dimensionamento de uma amostra de nanopartículas de ouro desconhecida pela AF4, juntamente com a detecção UV-vis usando calibração de tamanho externo com padrões de nanopartículas de ouro na faixa de tamanho de 20-100 nm. Este procedimento fornece uma descrição detalhada do fluxo de trabalho desenvolvido, incluindo preparação e qualificação de instrumentos AF4, desenvolvimento e fracionamento do método AF4 e fracionamento da amostra de nanopartículas de ouro desconhecida, bem como a correlação dos resultados obtidos com a calibração de tamanho externo estabelecida. O SOP descrito aqui foi eventualmente validado com sucesso no quadro de um estudo de comparação interlaboratorial destacando a excelente robustez e confiabilidade do AF4 para o dimensionamento de amostras de nanopartículas em suspensão.

Primeiro, os padrões de tamanho AuNP foram fracionados pelo AF4 e detectados por UV-vis medindo a absorção do AuNP em um comprimento de onda de 532 nm (ressonância de plasmon superficial de AuNP). Uma sobreposição dos fractogramas obtidos é apresentada na Figura 1. Os tempos de retenção de cada AuNP em seu respectivo pico UV-vis máximo obtido a partir de medições triplicadas estão listados na Tabela 5. O desvio padrão relativo de todos os tempos de retenção foi inferior a 1,1% com uma variação de medição decrescente com o aumento do tamanho. No geral, uma excelente repetibilidade foi alcançada. Foi aplicada uma força de separação constante, o que resultou em uma relação linear do tempo de elução e do tamanho hidrodinâmico. A linha de calibração de tamanho externo foi estabelecida plotando o raio hidrodinâmico especificado contra o tempo de eluição corrigido pelo tempo de vazio (tempo de retenção líquida). Uma análise de regressão linear resultou em uma função de calibração linear com uma interceptação a = -3,373 nm ± 1,716 nm e uma inclinação b = 1,209 nm∙min-1 ± 0,055 nm∙min-1. O comportamento linear da elução foi confirmado com coeficiente de correlação quadrado R2 de 0,9958. A respectiva função de calibração é exibida visualmente na Figura 2.
A segunda parte tratou da análise da amostra AuNP desconhecida. Três alíquotas da amostra foram preparadas de acordo com o procedimento descrito na seção de protocolo (seção 4.2). Cada uma das três alíquotas foi investigada em triplicado utilizando o mesmo método de fracionamento AF4 que também foi aplicado para as normas de tamanho AuNP. Todos os nove fractogramas AF4-UV-vis obtidos da amostra AuNP desconhecida são apresentados na Figura 3 e suas respectivas avaliações são resumidas na Tabela 6. O desvio padrão relativo dos respectivos tempos de retenção foi significativamente baixo e variou entre 0,1% e 0,5%. Utilizando-se a função de calibração do tamanho da partícula obtida a partir do fracionamento das normas de tamanho AuNP e correlacionando-a com os tempos de retenção obtidos da amostra AuNP desconhecida no máximo pico UV-vis, um raio hidrodinâmico médio global de 29,4 nm ± 0,2 nm poderia ser calculado. Além disso, obteve-se uma recuperação razoável de massa de 83,1% ± 1,2% indicando nenhuma aglomeração ou dissolução significativa da amostra de AuNP ou uma considerável adsorção de partículas na superfície da membrana. A Figura 4 exibe a distribuição do tamanho da partícula obtida com todos os nove traços de sinal UV-vis medianos, destacando a excelente robustez do método AF4 aplicado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Figura 1: Fractogramas AF4-UV-vis obtidos a partir da análise triplicada dos quatro padrões individuais de calibração de tamanho AuNP com intensidades de sinal normalizadas e taxa de fluxo cruzado constante aplicada (linha preta). O pico vazio é destacado em cinza em torno de 5,9 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Figura 2: Obteve função de calibração de tamanho externo, incluindo barras de erro derivadas dos respectivos desvios padrão das medidas DLS(Tabela 4) e variâncias nos tempos de retenção AF4 obtidos(Tabela 5),após traçar o raio hidrodinâmico especificado contra o tempo de retenção de cada padrão de calibração de tamanho AuNP individual em seu respectivo máximo pico. Uma função de calibração linear com erros padrão na forma de y = a + bx com a = -3,373 nm ± 1,716 nm e b = 1,209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1 foi calculado a partir de uma análise de regressão linear. Foi determinado um coeficiente de correlação ao quadrado com R2 = 0,9958, indicando uma relação linear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Figura 3: AF4-UV-vis fractogramas de medidas triplicadas de três alíquotas exibindo o AuNP desconhecido. A taxa de fluxo cruzado constante aplicada ao longo do tempo de medição é ilustrada como uma linha preta. O pico vazio em torno de 5,9 min é destacado em cinza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Figura 4: Sobreposição da distribuição média de tamanho de partícula obtida (vermelho) da amostra AuNP desconhecida e da função de calibração linear aplicada (linha pontilhada). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Componente</td>
			<td>CAS-Não</td>
			<td>Peso (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Água</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Ácido octadecenômico (Z)-, composto com 2,2',2''-nitrilotris[etanol](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Carbonato de sódio</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Álcoois, C12-14-secundários, etoxilatados</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tetrassódio EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polietileno glicol</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oleato de sódio</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bicarbonato de sódio</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Lista dos componentes da mistura surfactante utilizada para preparar o eluente (ver também Tabela de Materiais).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parâmetros AF4-UV-vis</td>
			<td>Unidade</td>
			<td>Valor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Espessura espaçada</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo do detector</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo cruzado</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (constante por 8 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo de foco</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de atraso / tempo de estabilização</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo de injeção</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de transição</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de injeção</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo de elução</td>
			<td>Min</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de passo de enxágüe</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo de passo de enxágüe</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume de injeção</td>
			<td>Μl</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentração amostral</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de membrana</td>
			<td></td>
			<td>Celulose regenerada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corte de peso molecular da membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluente</td>
			<td></td>
			<td>Mistura surfactante de 0,025% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento de onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilidade UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Resumo dos parâmetros do método de fracionamento AF4-UV-vis para realizar a execução da injeção direta sem a aplicação de uma força de separação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parâmetros AF4-UV-vis</td>
			<td>Unidade</td>
			<td>Valor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Espessura espaçada</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo do detector</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo cruzado</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (60 min constante, 10 min linear)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo de foco</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de atraso / tempo de estabilização</td>
			<td>Min</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo de injeção</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de transição</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de injeção</td>
			<td>Min</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo de elução</td>
			<td>Min</td>
			<td>70 (60 min constante, 10 min linear)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo de enxágüe</td>
			<td>Min</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taxa de fluxo de passo de enxágüe</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume de injeção</td>
			<td>Μl</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentração amostral</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de membrana</td>
			<td></td>
			<td>Celulose regenerada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corte de peso molecular da membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluente</td>
			<td></td>
			<td>Mistura surfactante de 0,025% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento de onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilidade UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Resumo dos parâmetros do método de fracionamento AF4-UV-vis para realizar a execução do fracionamento com a aplicação de um fluxo cruzado como força de separação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Padrão de calibração</td>
			<td>Agente capping</td>
			<td>Tamanho Médio (TEM) (nm)</td>
			<td>CV (tamanho médio TEM) (%)</td>
			<td>Potencial zeta (mV)</td>
			<td>SD (potencial zeta) (mV)</td>
			<td>Raio hidrodinâmico (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (raio hidrodinâmico) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Resumo dos parâmetros físico-químicos dos padrões de calibração AuNP aplicados, incluindo agente de capping, tamanho médio TEM, potencial zeta determinado na suspensão nativa, bem como raio hidrodinâmico DLS, e índice de polidispersidade (PDI) determinado no eluente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Padrão de calibração</td>
			<td>Executar</td>
			<td>Tempo de retenção no máximo (min)</td>
			<td>Tempo de retenção líquida no máximo de pico (min)</td>
			<td>Tempo médio de retenção líquida (min)</td>
			<td>SD (%) (tempo de retenção líquida)</td>
			<td>SD (min) (tempo de retenção líquida)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 5: Tempos de retenção das normas de calibração AuNP no respectivo pico UV-Vis máximo derivado dos respectivos fractogramas AF4-UV-vis utilizando o método descrito na Tabela 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Executar</td>
			<td>Máximo de tempo de retenção (min)</td>
			<td>Tempo médio de retenção no máximo (min)</td>
			<td>Tempo de retenção líquida no máximo de pico (min)</td>
			<td>SD (%) tempo de retenção</td>
			<td>Raio hidrodinâmico (nm)</td>
			<td>Recuperação (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 6: Resumo dos tempos de retenção no máximo máximo de pico UV-Vis, o raio hidrodinâmico calculado a partir da calibração de tamanho externo(Figura 2) e a taxa de recuperação da amostra AuNP desconhecida obtida a partir da análise AF4-UV-vis.

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Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Este protocolo descreve o uso de Fracionamento de Fluxo de Fluxo Assimétrico, juntamente com a detecção UV-vis para a determinação do tamanho de uma amostra de nanopartículas de ouro desconhecida.

Fracionamento de fluxo de fluxo assimétrico para dimensionamento de nanopartículas de ouro em suspensão

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K visualizações.  Postnova Analytics GmbH. Este protocolo descreve o uso de Fracionamento de Fluxo de Fluxo Assimétrico, juntamente com a detecção UV-vis para a determinação do tamanho de uma amostra de nanopartículas de ouro desconhecida.

Vídeo: Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Bioengenharia

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Proteína quinase C-delta inibidor do Peptide formulação utilizando nanopartículas de ouro

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...