Gli autori ringraziano l'intero consorzio ACEnano per le proficue discussioni in tutte le fasi della preparazione del protocollo qui presentato. Gli autori apprezzano anche i finanziamenti del programma Horizon 2020 dell'Unione europea (H2020) nell'ambito della sovvenzione nº 720952 nell'ambito del progetto ACEnano.

1. Configurazione del sistema AF4
<ol><li>Assemblare la cartuccia AF4 e collegare tutti i componenti hardware del sistema AF4 e del rivelatore UV-vis(Table of Materials)seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.</li>
	<li>Installare tutti i pacchetti software necessari per il controllo, l'acquisizione, l'elaborazione e la valutazione dei dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.</li>
	<li>Assicurarsi che siano state stabilite tutte le connessioni di segnale necessarie tra il sistema AF4 e il rilevatore UV-vis.</li>
	<li>Assicurarsi che le connessioni AF4-UV-vis stabilite siano strette e senza perdite scaricando la configurazione con acqua ultrapura (UPW) per 15 min (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1). Per fare ciò, aprire il software di controllo AF4 e inserire le portate nei rispettivi pannelli sul lato superiore destro della pagina di destinazione. Stringere i rispettivi connettori (raccordi), se necessario, e ripetere la procedura fino a quando non sono osservabili perdite. NOTA: La pressione interna del sistema durante tutte le misurazioni deve essere monitorata e deve essere entro 4-12 bar. Nel caso in cui la pressione sia più alta o inferiore, il tubo di contropressione deve essere regolato. Inoltre, l'andamento della pressione del canale dovrebbe essere costante durante l'intero tempo di misurazione. NOTA: Se è disponibile un forno a canale, impostare la sua temperatura a 25 °C per garantire condizioni di misurazione comparabili in tutti gli esperimenti AF4.</li>
</ol>2. Preparazione di soluzioni e sospensioni per la qualificazione del sistema AF4-UV-vis e l'analisi dei campioni
<ol><li>Soluzione per la pulizia<ol>
<li>Aggiungere 8 g di idrossido di sodio solido (NaOH) e 2 g di solfato di dodecil di sodio (SDS) a 1 L di UPW e mescolare la soluzione fino alla dissoluzione totale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluente<ol>
<li>Aggiungere 500 μL di miscela di tensioattivi filtrati a 2 L di UPW filtrato e degassato per ottenere l'eluente (0,025% (v/v), pH intorno al 9,4). NOTA: Una descrizione dettagliata dei composti della miscela di tensioattivi è riportata nella tabella 1 (anche tabella dei materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standard di dimensioni AuNP arbitrario per la determinazione del recupero di massa<ol>
<li>Vortice uno standard di dimensioni AuNP arbitrario (50 mg-L-1) per 2 minuti e diluirlo 1:4 con UPW per ottenere una concentrazione di massa finale di 12,5 mg-L-1. Vortice per ulteriori 2 minuti dopo la diluizione per omogeneizzare la sospensione ottenuta. ATTENZIONE: Sono necessarie misure precauzionali necessarie e dispositivi di protezione adeguati quando si lavora con sostanze chimiche, in particolare pellet NaOH. NOTA: Si consiglia generalmente di de-gas e filtrare tutte le soluzioni necessarie (ad eccezione della soluzione di pulizia) utilizzando un filtro a membrana da 0,1 μm (PVDF idrofilo o simile) per garantire sfondi di particelle bassi durante gli esperimenti AF4-UV-vis. Questo può essere stabilito da un'unità di filtrazione sottovuoto dedicata o utilizzando filtri per siringhe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Qualifica del sistema AF4-UV-vis
<ol><li>Utilizzare le impostazioni software descritte nel passaggio 1.4 per sciacquare il sistema con la soluzione di pulizia per 30 min (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1).</li>
	<li>Cambiare il rispettivo flacone eluente e sciacquare il sistema con UPW per 20 min (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1).</li>
	<li>Sostituire i rispettivi filtri pompa in linea.</li>
	<li>Aprire la cartuccia AF4 e sostituire la membrana AF4. Rimontare la cartuccia AF4 e ricollegarla al sistema AF4-UV-vis.</li>
	<li>Sciacquare il sistema AF4-UV-vis pulito con l'eluente per almeno 30 minuti al fine di equilibrare la membrana e stabilizzare il sistema (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1). Verificare nuovamente la presenza di potenziali perdite (vedere il passaggio 1.4).</li>
	<li>Qualificare il sistema AF4-UV-vis determinando il recupero di massa e la variazione del tempo di ritenzione utilizzando uno standard di dimensioni AuNP arbitrario.<ol>
<li>Eseguire un'esecuzione di iniezione diretta senza applicazione di una forza di separazione.<ol>
<li>Creare un nuovo file di misurazione aprendo File | Nuovo | Eseguire nel software di controllo AF4.</li>
			<li>Definire la descrizione del campione e della misurazione, nonché il volume di iniezione e il nome del campione all'interno della scheda Esegui. Le condizioni di misurazione sono visualizzate nella tabella 2.</li>
			<li>Impostare i parametri di misurazione nel metodo FFF della seconda scheda in base alla tabella 2.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante Esegui per avviare la misurazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire un'esecuzione di frazionamento con l'applicazione di una forza di separazione (cross flow).<ol>
<li>Definire il metodo di frazionamento descritto nella sezione precedente utilizzando le condizioni di frazionamento specificate nella tabella 3.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante Esegui per avviare la misurazione.</li>
			<li>Eseguire la misurazione in quadruplicazione. NOTA: La prima manche mira a condizionare l'impianto (cioè la membrana AF4) e sarà esclusa dalla valutazione finale dei risultati delle qualifiche del sistema. NOTA: si consiglia di salvare tutti i file eseguiti generati aprendo File | Salvare nel software di controllo AF4.</li>
			<li>Si consideri il sistema AF4-UV-vis qualificato se si ottiene un recupero di massa di >80% e una variazione del tempo di ritenzione <2% per lo standard di dimensione AuNP arbitrario.</li>
			<li>Quando si utilizza un autocampionatore come sistema di iniezione, riempire il flacone del serbatoio di lavaggio dell'ago dell'autocampionatore con la stessa soluzione che viene pompata attraverso il sistema AF4-UV-vis (ad esempio, soluzione di pulizia, UPW o rispettivo eluente) per garantire condizioni di funzionamento ottimali. Quando si cambia l'eluente, si consiglia generalmente di seguire il ri-equilibrazione del sistema AF4 monitorando il segnale UV-vis-detector fino a quando la sua linea di base rimane stabile a un livello costante.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi del campione AF4-UV-vis
<ol><li>Preparare tutti gli standard di dimensione AuNP per la calibrazione delle dimensioni esterne vortice delle rispettive sospensioni AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, ciascuna 50 mg. L-1) per 2 min e diluirlo 1:4 con UPW per ottenere una concentrazione di massa finale di 12,5 mg-L-1. Vortice per ulteriori 2 minuti dopo la diluizione per omogeneizzare le sospensioni ottenute.</li>
	<li>Preparare il campione AuNP sconosciuto per l'analisi applicando la stessa procedura degli standard di calibrazione descritti al passaggio 4.1.</li>
	<li>Eseguire una misurazione ad iniezione diretta di tutti gli standard di dimensione AuNP utilizzando il metodo AF4 visualizzato nella tabella 2.<ol>
<li>A tal fine, inserire i rispettivi valori riassunti nella tabella 2 nel software del produttore nelle posizioni appropriate per definire i parametri di separazione e campione e premere il pulsante Esegui per avviare l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frazionare ogni standard di dimensione AuNP singolarmente utilizzando il metodo AF4 visualizzato nella tabella 3 per stabilire la funzione di calibrazione delle dimensioni esterne.<ol>
<li>Inserire i rispettivi valori riassunti nella tabella 3 nel software del fabbricante nelle posizioni appropriate. Il metodo di frazionamento è definito da una fase di messa a fuoco, diversi passaggi di eluizione e un passaggio di risciacquo. Dopo aver impostazione il metodo, premere il pulsante Esegui per avviare l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire una misurazione ad iniezione diretta dell'ignoto campione AuNP utilizzando il metodo AF4 visualizzato nella tabella 2.</li>
	<li>Eseguire il frazionamento del campione AuNP sconosciuto conducendo il metodo AF4 elencato nella tabella 3.</li>
	<li>Effettuare tutte le misurazioni di cui alle sezioni 3 e 4 in triplice copia, salvo diversa indicazione, per garantire risultati significativi e statisticamente rilevanti.<ol>
<li>Conservare 50 mg-L-1 Sospensioni stock AuNP a 4-8 °C prima dell'uso. Le sospensioni AuNP diluite sono preparate idealmente entro 30 minuti prima dell'applicazione. NOTA: Il vortice è solitamente sufficiente e non è necessaria alcuna ultrasonicazione delle sospensioni.</li>
		<li>Al fine di abilitare una correlazione del tempo di ritenzione del campione AuNP sconosciuto con i tempi di ritenzione ottenuti per gli standard di dimensione AuNP, misurare tutti i campioni utilizzando lo stesso metodo AF4. NOTA: Per garantire condizioni di separazione costanti e valide, includere/ripetere la fase di frazionamento descritta nella sezione di qualificazione del sistema (vedere fase 3.6.2) dopo un numero definito di misurazioni del campione (ad esempio, 10 misurazioni). Inoltre, registra la pressione del sistema e la stabilità della linea di base del rivelatore UV-vis. Dovrebbero rimanere stabili e costanti lungo una corsa COMPLETA AF4-UV-vis. NOTA: Di solito, sostituire la membrana di ultrafiltrazione quando il rivelatore UV-vis (o il rivelatore MALS (Multi Angle Light Scattering), se disponibile) mostra un aumento del livello di rumore o i criteri di qualificazione del sistema definiti come il recupero, la forma del picco del campione o la ripetibilità (o il sistema AF4-UV-vis è stato sottoposto a una procedura di pulizia accurata). Nelle condizioni qui descritte, il sistema AF4-UV-vis qualificato è solitamente stabile per almeno 50 misurazioni utilizzando la stessa membrana; tuttavia, il numero di possibili misurazioni consecutive che soddisfa i criteri di qualità definiti può variare significativamente a seconda del campione, della matrice del campione e della composizione eluente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Valutazione dei dati
<ol><li>Eseguire il calcolo del recupero di massa utilizzando il software di valutazione dei dati fornito dal produttore del sistema AF4-UV-vis o l'analisi del foglio di calcolo dopo l'esportazione di tutti i dati grezzi necessari (ad esempio, area di picco UV-vis) dal rispettivo software di acquisizione dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.<ol>
<li>Calcolare il recupero di massa AuNP confrontando le aree sotto i rispettivi picchi UV-vis della misurazione del frazionamento (unfrazionamento)e la misurazione dell'iniezione diretta (Adirect injection)utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> NOTA: Durante una misurazione dell'iniezione diretta, non viene applicata alcuna forza di separazione e quindi le potenziali interazioni di una specie di alita con la parete di accumulo possono essere trascurate. L'area sotto un rispettivo picco UV-vis può essere direttamente correlata alla massa AuNP usando la legge di Beer-Lambert supponendo che nessun'altra specie all'interno del campione assorba alla rispettiva lunghezza d'onda e /o i) eluisce in un altro tempo di ritenzione in condizioni di frazionamento ii) viene rimossa attraverso la membrana AF4.</li>
		<li>Importare i file dat.</li>
		<li>Selezionate la traccia del rilevatore UV-vis nella scheda Panoramica (Overview).</li>
		<li>Definire una regione di interesse (ROI) e una linea di base nella vista segnale e linea di base per tutte le misurazioni.</li>
		<li>Inserire una calibrazione ad iniezione diretta tramite inserto.</li>
		<li>Selezionare tutte le esecuzioni di iniezione diretta nella visualizzazione Impostazioni di calibrazione a iniezione diretta e immettere un coefficiente di estinzione UV. NOTA: È importante utilizzare lo stesso coefficiente di estinzione UV-vis sia per la calibrazione che per la misurazione del frazionamento.</li>
		<li>Stabilire la linea di calibrazione utilizzando l'area sotto la traccia del segnale UV-vis all'interno del ROI e la quantità iniettata calcolata dalla concentrazione immessa e dal volume di iniezione. La calibrazione ottenuta verrà visualizzata nella finestra funzione di calibrazione ad iniezione diretta separata.</li>
		<li>Assegnare la funzione di calibrazione alle rispettive misurazioni del frazionamento. NOTA: Per ogni standard di dimensione di calibrazione e il campione AuNP sconosciuto, è necessario stabilire una funzione di calibrazione separata a causa dell'assorbanza UV-vis dipendente dalle dimensioni di AuNP. Questo inconveniente del rilevatore UV-vis può essere aggirato utilizzando un rilevatore sensibile alla massa come un ICP-MS.</li>
		<li>Eseguire le analisi inserendo un calcolo dei risultati quantitativi e i risultati verranno visualizzati all'interno di una tabella a destra come valori di concentrazione e quantità iniettata.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcola la variazione del tempo di conservazione utilizzando il software di valutazione dei dati fornito dal produttore del sistema AF4 o l'analisi del foglio di calcolo dopo l'esportazione di tutti i dati grezzi necessari (cioè i tempi di conservazione degli standard di calibrazione AuNP ai rispettivi massimi di picco UV-vis e i rispettivi tempi di vuoto) dal rispettivo software di acquisizione dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.<ol>
<li>Aprire la finestra Panoramica per visualizzare le rispettive tracce UV per tutte le misurazioni importate.</li>
		<li>Il rilevamento dei picchi verrà eseguito automaticamente; regolare i parametri di rilevamento dei picchi all'interno della casella degli strumenti di elaborazione del segnale per ottimizzare le prestazioni. Estrarre i rispettivi massimi di picco passando attraverso tutti i file di misurazione.</li>
		<li>Calcolare la deviazione standard relativa per tutte le misurazioni utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> Il calcolo può anche essere eseguito utilizzando un rispettivo software per fogli di calcolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la determinazione delle dimensioni utilizzando il software di valutazione dei dati fornito dal produttore o l'analisi del foglio di calcolo dopo l'esportazione di tutti i dati grezzi necessari (tempo di conservazione al picco UV-vis massimo di alita e rispettivo tempo di vuoto) dal rispettivo software di acquisizione dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore. È possibile stabilire una funzione di calibrazione delle dimensioni esterne tracciando i tempi di ritenzione corretti per il tempo vuoto (tempi di ritenzione netti,cfr. tabella 5 ) degli standard di dimensione AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) rispetto alle loro dimensioni idrodinamiche ottenute da misurazioni DLS precedentemente eseguite (vedere tabella 4). NOTA: Le misurazioni DLS devono essere effettuate idealmente lo stesso giorno delle rispettive misurazioni del frazionamento per garantire proprietà del campione comparabili.<ol>
<li>Dopo aver importato .dat file, tutte le misurazioni vengono visualizzate nella scheda Panoramica. Selezionate il segnale del rivelatore UV-vis dall'elenco dei rivelatori, visualizzato sotto la finestra di sovrapposizione. Definire un ROI e una linea di base per ogni misurazione, che possono essere regolati nella vista Segnale e Linea di base. Utilizzare la casella degli strumenti di elaborazione del segnale a destra per smussare i segnali rumorosi. Utilizzare la funzione Assegna parametri di elaborazione ad altre esecuzioni per consentire l'allocazione dei parametri ad altre misurazioni, rispettivamente segnali.</li>
		<li>Selezionate la calibrazione delle dimensioni delle particelle dalla scheda Inserisci( Insert).</li>
		<li>Selezionare tutte le esecuzioni di calibrazione facendo clic sulla rispettiva misurazione nella tabella Seleziona riferimenti per calibrazione nella parte superiore destra. Tutte le misurazioni selezionate verranno visualizzate in una tabella sottostante. Immettere il raggio idrodinamico per tutte le misurazioni di calibrazione specificate nella tabella 4. La funzione verrà visualizzata nella calibrazione delle dimensioni delle particelle - Funzione e verrà visualizzata anche l'equazione. NOTA: Il coefficiente di correlazione (R2)della funzione di calibrazione delle dimensioni stabilita deve essere ≥0,990.</li>
		<li>Assegnate la funzione di calibrazione alle misurazioni del campione AuNP sconosciuto selezionando i rispettivi frazionamento all'interno dell'elenco Seleziona esecuzioni per assegnazione.</li>
		<li>Visualizzare i risultati aprendo un calcolo della distribuzione delle dimensioni delle particelle all'interno della scheda inserisci. La calibrazione delle dimensioni delle particelle creata in precedenza verrà elencata come calibrazione per le misurazioni del campione AuNP sconosciute, che viene visualizzata nelle impostazioni della finestra destra. La dimensione calcolata verrà visualizzata nella finestra di distribuzione delle dimensioni etichettata al massimo di picco. Selezionare la casella di controllo Segnali medi per campione per in media tutte le misurazioni di un campione ed elencare il risultato nell'etichetta massima di picco.</li>
		<li>Inoltre, tracciate la linea di calibrazione sul fractogramma selezionando la casella di controllo Mostra curva di calibrazione. È disponibile una distribuzione cumulativa delle dimensioni selezionando la casella di controllo Mostra distribuzione cumulativa. NOTA: quando si utilizza il software del produttore per la valutazione dei dati, si consiglia di aggiungere tutti i risultati a un report, che può essere generato facendo clic su Report all'interno della scheda Inserisci. Il pulsante Report aggiunge tutti i risultati, le tabelle e i diagrammi a un documento. Nella scheda Report è possibile modificare le impostazioni del report aprendo l'impostazione Report all'interno della sezione Documento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Tutti gli autori di questo manoscritto sono dipendenti di Postnova Analytics GmbH, i cui prodotti sono utilizzati in questo protocollo.

La dimensione idrodinamica di un AuNP sconosciuto è stata accuratamente valutata da AF4 accoppiata con un rivelatore UV-vis utilizzando standard di dimensioni AuNP ben definiti che vanno da 20 nm a 100 nm. Il metodo AF4 sviluppato è stato ottimizzato utilizzando un profilo di flusso incrociato costante al fine di stabilire una relazione lineare tra il tempo di ritenzione misurato e le dimensioni AuNP, consentendo così una semplice determinazione delle dimensioni dall'analisi di regressione lineare. Particolare attenzione è stata rivolta anche al raggiungimento di tassi di recupero sufficientemente elevati che non indicano alcuna perdita significativa del campione durante il frazionamento e che il metodo AF4 sviluppato, compresi l'eluente applicato e la membrana, corrispondeva bene a tutti i campioni AuNP frazionati.
Lo sviluppo del metodo è probabilmente il passaggio più critico in AF4 e diversi parametri, tra cui dimensioni del canale, parametri di flusso e proprietà eluenti, membrane, distanziale e persino proprietà del campione devono essere presi in considerazione per migliorare il frazionamento all'interno di una data finestra di tempo di eluizione. Lo scopo di questo paragrafo è quello di guidare il lettore attraverso i passaggi critici ottimizzati per determinare con successo le dimensioni dell'esempio AuNP sconosciuto discusso qui. Per una descrizione più dettagliata di come sviluppare generalmente un metodo AF4, il lettore è indirizzato alla sezione AF4 di 'ISO/TS21362:2018 - Nanotecnologie - Analisi di nano-oggetti utilizzando flusso asimmetrico e frazionamento campo-flusso centrifugo'25. Guardando più da vicino le condizioni di frazionamento applicate fornite nella tabella 3, il primo passo critico è l'introduzione e il rilassamento del campione AuNP nel canale AF4. Questo passaggio è regolato dal flusso di iniezione, dal flusso di messa a fuoco e dal flusso trasversale, la cui interazione costringe il campione a localizzare vicino alla superficie della membrana e a concentrarlo in una banda stretta vicino alla porta di iniezione del canale AF4 definendo fondamentalmente il punto di partenza del frazionamento. Un sufficiente rilassamento del campione è obbligatorio in quanto durante questa fase, i costituenti campione di diverse dimensioni si localizzino in diverse altezze del canale AF4 fornendo così la base per un frazionamento di dimensioni di successo. Il rilassamento incompleto del campione è solitamente visibile da un'area di picco del vuoto aumentata risultante da costituenti campione non contaminati (cioè non rilassati). Questo effetto può essere mitigato aumentando il tempo di iniezione e/o la portata incrociata applicata. Tuttavia, entrambi i parametri necessitano di un'attenta ottimizzazione, specialmente per i campioni soggetti ad agglomerazione e adsorbimento sulla membrana AF4, e possono essere monitorati dai rispettivi tassi di recupero ottenuti per diverseimpostazioni di parametro 36,37. Il tempo di iniezione applicato di 5 minuti insieme a una portata trasversale di 1,0 mL-min-1 ha rivelato tassi di recupero >80% per tutti i campioni AuNP e un'area di picco del vuoto trascurabile che indica condizioni di rilassamento quasi ottimali. Dopo un sufficiente rilassamento del campione AuNP, il flusso di messa a fuoco è stato interrotto ed è stato avviato il trasporto del campione lungo la lunghezza del canale AF4 fino al rispettivo rivelatore UV-vis che rappresenta il secondo passaggio critico. Al fine di garantire una potenza di frazionamento sufficientemente elevata a tempi di analisi ragionevoli, è stata applicata una portata trasversale costante di 1,0 mL-min-1 per 30-50 min (a seconda del rispettivo standard di dimensione AuNP frazionata) seguita da un decadimento lineare del flusso trasversale di 10 minuti ad una portata del rivelatore di 0,5 mL.min-1. L'uso di un profilo di flusso incrociato costante attraverso la separazione di tutti gli standard di dimensione AuNP ha rivelato una relazione lineare tra il tempo di ritenzione e la dimensione AuNP dopo la teoria FFF22, consentendo così la determinazione delle dimensioni del campione AuNP sconosciuto mediante una semplice analisi di regressione lineare. Tuttavia, profili diversi da un flusso incrociato costante sono stati sfruttati anche per il dimensionamento delle nanoparticelle, portando infine a una relazione non lineare tra tempo di ritenzione e dimensione delleparticelle 38,39. Inoltre, la determinazione delle dimensioni in AF4 utilizzando standard di dimensioni ben definiti non è limitata all'AuNP, ma può anche essere applicata a nanoparticelle con altre dimensioni e composizione elementare (ad esempio,argento 38,40 o nanoparticelle di silice41,42). Inoltre, quando si lavora con campioni diluiti, ICP-MS è un rivelatore elementale altamente sensibile, che può essere accoppiato con AF4, aggiungendo alla versatilità di questo approccio analitico per il dimensionamento di una grande varietà di nanoparticelle in sospensione.
Nonostante la sua ampia applicazione, la calibrazione delle dimensioni esterne utilizzando standard di dimensioni ben definiti in AF4 ha alcune peculiarità che devono essere prese in considerazione quando la si utilizza per il dimensionamento accurato di campioni sconosciuti. In primo luogo, si basa fortemente sull'applicazione di condizioni comparabili durante il frazionamento dei rispettivi standard di dimensione e del campione effettivo. Nel caso qui presentato, è quindi obbligatorio che sia gli standard di dimensione AuNP che l'ignoto campione AuNP siano frazionati utilizzando lo stesso metodo AF4 così come lo stesso eluente e la stessa membrana rendendo questo approccio abbastanza inflessibile. Inoltre, non avendo rilevatori sensibili alle dimensioni, ad esempio lo scattering della luce (MALS e DLS) a portata di mano, è difficile determinare se un rispettivo metodo AF4 che utilizza standard di dimensione funzioni sufficientemente bene o meno. Ciò vale in particolare per campioni sconosciuti che presentano distribuzioni di dimensioni molto ampie, dove non è chiaro se tutti i costituenti del campione seguano il normale modello di eluizione: frazionamento da particelle più piccole a particelle più grandi, o se costituenti campione più grandi già eluti in modalità sterico-iperstrato, quindi potenzialmente co-eluizione con costituenti campione piùpiccoli 43,44. Inoltre, anche se la teoria FFF sottolinea che AF4 si separa esclusivamente in base alle differenze di dimensione idrodinamica con particelle considerate masse puntili senza alcuna interazione con il loroambiente 22, la realtà racconta una storia diversa con le interazioni particella-particella e particella-membrana (come attrazione elettrostatica / repulsione o attrazione di van-der-Waals) può svolgere un ruolo considerevole e può potenzialmente introdurre una distorsione misurabile nelle determinazioni delle dimensioni attraverso la calibrazione delle dimensioniesterne 45,46. Si raccomanda pertanto di utilizzare standard di dimensione che corrispondano idealmente alla composizione e alle proprietà superficiali (potenziale Zeta) della particella di interesse40,42 o, se questi non sono disponibili, almeno utilizzare standard di dimensione delle particelle ben caratterizzati (ad esempio, particelle di lattice di polistirolo) e valutarne attentamente la comparabilità con la particella di interesse soprattutto in termini di potenziale Zeta superficiale nel rispettivo ambiente, in cui l'analisi deve essereeffettuata 41,47.
La versatilità di AF4 è spesso considerata la sua massima forza, in quanto offre una gamma di applicazioni che va oltre la maggior parte delle altre tecniche di dimensionamento comuni inquesto campo 22,48,49. Allo stesso tempo, a causa della sua complessità presumibilmente associata, può anche essere considerato il suo svantaggio più significativo soprattutto contro tecniche di dimensionamento veloci e apparentemente facili da usare come DLS, Nanoparticle Tracking Analysis o ICP-MS a singola particella. Tuttavia, quando si mette AF4 in prospettiva con queste popolari tecniche di dimensionamento, diventa chiaro che tutte le tecniche hanno i loro pro e contro, ma tutte contribuiscono a una comprensione più completa della natura fisico-chimica delle nanoparticelle e dovrebbero quindi essere considerate complementari piuttosto che competitive.
La procedura operativa standard (SOP) qui presentata, evidenzia l'eccellente applicabilità di AF4-UV-vis con calibrazione delle dimensioni esterne per il dimensionamento di un campione AuNP sconosciuto in sospensione ed è stata infine applicata come linea guida raccomandata per l'analisi AF4 di un campione AuNP sconosciuto all'interno di un confronto interlaboratorio internazionale (ILC) che è stato condotto nell'ambito del progetto Horizon 2020, ACEnano (il risultato di questo ILC sarà oggetto di una futura pubblicazione). Questo protocollo, pertanto, si aggiunge agli incoraggianti e continui sforzi internazionali per convalidare e standardizzare le metodologie AF425,50,51,52 sottolineando il promettente potenziale di AF4 nel campo della caratterizzazione delle nanoparticelle.

Le nanoparticelle d'oro (AuNP) sotto forma di oro colloidale avevano fatto parte della cultura umana molto prima che ci fosse una comprensione di cosa fossero le nanoparticelle e prima che il termine nanoparticella avesse trovato la sua strada nel vocabolario scientifico contemporaneo. Senza una conoscenza distinta del loro aspetto su scala nanometrica, l'AuNP sospeso era già stato utilizzato per scopi medici e di altro tipo nell'antica Cina, Arabia e India nei secoli V-VIa.C. 1, eanche gli antichi romani approfittarono del loro colore rosso rubino per macchiare notoriamente le loro ceramiche nella mostra Lycurgus Cup nel British Museum2. Nel mondo occidentale, nel corso dei secoli dal Medioevo all'era moderna, l'AuNP sospeso era usato prevalentemente come colorante per il vetro e lo smalto (viola di Cassio)3, nonché per trattare una varietà di malattie (oro potabile), in particolare la sifilide4.
Tuttavia, tutti questi studi si erano concentrati principalmente sull'applicazione dell'AuNP sospeso e spettava a Michael Faraday nel 1857 introdurre il primo approccio razionale per indagare la loro formazione, la loro natura e le loro proprietà5. Sebbene Faraday fosse già consapevole che questi AuNP devono avere dimensioni molto minute, non è stato fino allo sviluppo della microscopia elettronica quando informazioni esplicite sulla loro distribuzione delle dimensionierano accessibili 6,7 , consentendo infine lacorrelazionetra le dimensioni e altre proprietà AuNP.
Al giorno d'oggi, grazie alla loro sintesi abbastanza facile e diretta, alle notevoli proprietà ottiche (risonanza plasmonica superficiale), alla buona stabilità chimica e quindi alla tossicità minore, nonché alla loro elevata versatilità in termini di dimensioni disponibili e modifiche superficiali, AuNP ha trovato applicazioni diffuse in campi come la nanoelettronica8,la diagnostica9,la terapia delcancro 10o la somministrazione difarmaci 11. Ovviamente, per queste applicazioni, una conoscenza precisa delle dimensioni e della distribuzione delle dimensioni dell'AuNP applicato è un prerequisito fondamentale per garantire un'efficaciaottimale 12 e vi è una notevole richiesta di strumenti robusti e affidabili per determinare questo parametro fisico-chimico cruciale. Oggi esiste una pletora di tecniche analitiche in grado di dimensionare AuNP in sospensione, tra cui, ad esempio, spettroscopia UV-vis (UV-vis)13, Dynamic Light Scattering (DLS)14 o Spettrometria di massa plasmatica accoppiata induttivamente a particella singola (spICP-MS)15 con frazionamento campo-flusso (FFF) che è un attore chiave inquesto campo 16,17,18,19,20.
Concettualizzato per la prima volta nel 1966 da J. Calvin Giddings21, FFF comprende una famiglia di tecniche di frazionamento basate sull'eluizione, dove la separazione avviene all'interno di un canale sottile simile a un nastro senza una fasestazionaria 22,23. In FFF, la separazione è indotta dall'interazione di un campione con un campo di forza esterno che agisce perpendicolarmente alla direzione di un flusso di canale laminare, in cui il campione viene trasportato a valle di solito verso i rispettivi rivelatori in linea. Tra queste tecniche FFF correlate, il frazionamento asimmetrico campo-flusso di flusso (AF4), dove un secondo flusso (flusso trasversale) agisce come campo di forza, è diventato il sottotipo24 più utilizzato. In AF4, il fondo del canale (parete di accumulo) è dotato di una membrana di ultrafiltrazione semipermeabile in grado di trattenere il campione consentendo allo stesso tempo al flusso trasversale di passare attraverso la membrana e lasciare il canale tramite una presa extra. Con questo mezzo, il flusso trasversale può spingere il campione verso la parete di accumulo contrastando così il suo flusso indotto dalla diffusione (moto browniano). In un conseguente equilibrio di flussi indotti dal campo e dalla diffusione; i costituenti campione più piccoli che presentano coefficienti di diffusione più elevati si allineano più vicino al centro del canale, mentre i costituenti campione più grandi che presentano coefficienti di diffusione più bassi si individuano più vicino alla parete di accumulo. A causa del profilo di flusso parabolico all'interno del canale, i costituenti del campione più piccoli vengono quindi trasportati nelle lamina più veloci del flusso del canale ed eluiscono prima di costituenti campione più grandi. Utilizzando il parametro di ritenzione FFF e le equazioni del coefficiente di diffusione di Stokes-Einstein, il tempo di eluizione e, rispettivamente, il volume di eluizione di un campione in AF4 possono quindi essere tradotti direttamente nella sua dimensione idrodinamica22. Qui il comportamento di eluizione descritto si riferisce alla normale modalità di eluizione ed è solitamente valido per AF4 all'interno di un intervallo di dimensione delle particelle compreso tra circa 1-500 nm (a volte fino a 2000 nm a seconda delle proprietà delle particelle e dei parametri di frazionamento) mentre l'eluizione sterico-iperstrato di solito si verifica al di sopra di questa sogliadi dimensione 25.
Esistono tre modi comuni per ricavare informazioni sulle dimensioni dopo la separazione per FFF. Poiché FFF è uno strumento modulare, può essere combinato a valle con più rivelatori come rilevatori di diffusione della luce sensibili alle dimensioni basati sul principio dello scattering della luce multi-angolo (MALS)26,27,Dynamic Light Scattering (DLS)28,29o anche una combinazione di entrambi per ottenere ulteriori informazioni sullaforma 30,31. Tuttavia, poiché il comportamento di ritenzione di un campione in un canale FFF è generalmente governato da forze fisiche ben definite, le dimensioni possono anche essere calcolate utilizzando un approccio matematico (teoria FFF), in cui un semplice rivelatore di concentrazione (ad esempio, un rivelatore UV-vis) è sufficiente per indicare la presenza di un campione di eluizione32,33.
Come terza opzione, qui segnalamo l'applicazione di una calibrazione delle dimensioniesterne 34,35 utilizzando standard AuNP ben definiti nell'intervallo di dimensioni di 20-100 nm per il dimensionamento di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto in sospensione utilizzando AF4 accoppiato con il rilevamento UV-vis. Questa semplice configurazione sperimentale è stata scelta apposta per consentire al maggior numero possibile di laboratori di aderire a un confronto interlaboratorio internazionale (ILC), che è stato successivamente eseguito nell'ambito del progetto Horizon 2020 dell'Unione Europea ACEnano sulla base del protocollo qui presentato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-FIL-TEF-002</td>
			<td>Used for filtration of aqueous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Durapore Millex</td>
			<td>Used for filtration of NovaChem100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Research Plus</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 cartridge</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ENTRIS124I-1S</td>
			<td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN5300</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel Oven</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN4020</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossflow Module</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF Control Module</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>ep T.I.P.S</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>1-0199</td>
			<td>Used for eluent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1131</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>VIA-002</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaCal Gold</td>
			<td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VIBRAX-VXR</td>
			<td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer (PC)</td>
			<td>Dell Technologies</td>
			<td>/</td>
			<td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>In accordance with respective laboratory&#8217;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-VIA-09150868</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &#8805;99 %, Blotting Grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>2326.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &#8805;98 %, p.a</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Control and Data Acquisition</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaFFF AF2000 Software</td>
			<td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Data Evaluation</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaAnalysis Software</td>
			<td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for final Data Processing</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Origin 2019</td>
			<td>Used for final data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Degasser</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7520</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Selector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7310</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Organizer</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7140</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant Mixture</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaChem100</td>
			<td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1130</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unknown AuNP sample</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC60</td>
			<td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis Detector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN3211</td>
			<td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Eluent Filtration System</td>
			<td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Milli-Q Integral 5</td>
			<td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&#937;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

La dimensione delle particelle è probabilmente il parametro fisico-chimico più importante associato alla nozione di nanoparticella. Una conoscenza precisa delle dimensioni e della distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle è della massima importanza per varie applicazioni. Anche l'intervallo di dimensioni è importante, in quanto definisce il componente più "attivo" di una dose di nanoparticelle.
Il frazionamento asimmetrico campo-flusso di flusso (AF4) è una potente tecnica per il dimensionamento delle particelle in sospensione nell'intervallo di dimensioni di circa 1-1000 nm. Esistono diversi modi per ricavare informazioni sulle dimensioni da un esperimento AF4. Oltre ad associare AF4 online a rivelatori sensibili alle dimensioni basati sui principi dello scattering della luce multi-angolo o dello scattering dinamico della luce, c'è anche la possibilità di correlare le dimensioni di un campione con il suo tempo di ritenzione utilizzando un approccio teorico ben consolidato (teoria FFF) o confrontandolo con i tempi di ritenzione di standard di dimensione delle particelle ben definiti (calibrazione delle dimensioni esterne).
Qui descriviamo lo sviluppo e la convalida interna di una procedura operativa standard (SOP) per il dimensionamento di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto da AF4 accoppiato con il rilevamento UV-vis utilizzando la calibrazione delle dimensioni esterne con standard di nanoparticelle d'oro nell'intervallo di dimensioni di 20-100 nm. Questa procedura fornisce una descrizione dettagliata del flusso di lavoro sviluppato, tra cui la preparazione del campione, la configurazione e la qualificazione dello strumento AF4, lo sviluppo del metodo AF4 e il frazionamento del campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto, nonché la correlazione dei risultati ottenuti con la calibrazione delle dimensioni esterne stabilita. Il SOP qui descritto è stato infine convalidato con successo nel quadro di uno studio di confronto interlaboratorio che evidenzia l'eccellente robustezza e affidabilità di AF4 per il dimensionamento di campioni di nanoparticolati in sospensione.

In primo luogo, gli standard di dimensione AuNP sono stati frazionati da AF4 e rilevati da UV-vis che misurano l'assorbanza dell'AuNP ad una lunghezza d'onda di 532 nm (risonanza plasmonica superficiale dell'AuNP). Una sovrapposizione dei fractogrammi ottenuti è presentata nella figura 1. I tempi di ritenzione di ciascun AuNP al rispettivo massimo UV-vis ottenuto dalle misurazioni del triplice copia sono elencati nella tabella 5. La deviazione standard relativa di tutti i tempi di ritenzione era inferiore all'1,1% con una varianza di misura decrescente con dimensioni crescenti. Nel complesso, è stata raggiunta un'eccellente ripetibilità. Fu applicata una forza di separazione costante, che portò ad una relazione lineare tra tempo di eluizione e dimensione idrodinamica. La linea di calibrazione delle dimensioni esterne è stata stabilita tracciando il raggio idrodinamico specificato rispetto al tempo vuoto corretto per il tempo di eluizione (tempo di ritenzione netto). Un'analisi di regressione lineare ha portato a una funzione di calibrazione lineare con un'intercetta a = -3,373 nm ± 1,716 nm e una pendenza b = 1,209 nm-min-1 ± 0,055 nm-min-1. Il comportamento lineare dell'eluizione è stato confermato con un coefficiente di correlazione al quadrato R2 di 0,9958. La rispettiva funzione di calibrazione viene visualizzata visivamente nella figura 2.
La seconda parte si è occupata dell'analisi del campione aunp sconosciuto. Tre aliquote del campione sono state preparate secondo la procedura descritta nella sezione relativa al protocollo (sezione 4.2). Ognuna delle tre aliquote è stata studiata in triplice copia utilizzando lo stesso metodo di frazionamento AF4 che è stato applicato anche per gli standard di dimensione AuNP. Tutti i nove fractogrammi AF4-UV-vis ottenuti del campione AuNP sconosciuto sono presentati nella figura 3 e le rispettive valutazioni sono riassunte nella tabella 6. La deviazione standard relativa dei rispettivi tempi di ritenzione è stata significativamente bassa e variava tra lo 0,1% e lo 0,5%. Utilizzando la funzione di calibrazione delle dimensioni delle particelle ottenuta dal frazionamento degli standard di dimensione AuNP e correlandolo con i tempi di ritenzione ottenuti del campione AuNP sconosciuto al picco UV-vis massimo, è stato possibile calcolare un raggio idrodinamico medio complessivo di 29,4 nm ± 0,2 nm. Inoltre, è stato ottenuto un ragionevole recupero di massa dell'83,1% ± l'1,2% che non indica un agglomerato o una dissoluzione significativi del campione AuNP o un notevole assorbimento di particelle sulla superficie della membrana. La figura 4 mostra la distribuzione delle dimensioni delle particelle ottenuta con tutte e nove le tracce di segnale UV-vis mediate evidenziando l'eccellente robustezza del metodo AF4 applicato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Figura 1: Fractogrammi AF4-UV-vis ottenuti dall'analisi triplicata dei quattro singoli standard di calibrazione delle dimensioni AuNP con intensità del segnale normalizzate e portata trasversale costante applicata (linea nera). Il picco di vuoto è evidenziato in grigio a circa 5,9 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Figura 2: Funzione di calibrazione delle dimensioni esterne ottenuta, comprese le barre di errore derivate dalle rispettive deviazioni standard delle misurazioni DLS (tabella 4) e le varianze nei tempi di ritenzione AF4 ottenuti (Tabella 5), dopo aver tracciato il raggio idrodinamico specificato rispetto al tempo di ritenzione di ogni singolo standard di calibrazione delle dimensioni AuNP al rispettivo picco massimo. Una funzione di calibrazione lineare con errori standard sotto forma di y = a + bx con a = -3,373 nm ± 1,716 nm e b = 1,209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1 è stata calcolata da un'analisi di regressione lineare. È stato determinato un coefficiente di correlazione al quadrato con R2 = 0,9958, che indica una relazione lineare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Figura 3: Fractogrammi AF4-UV-vis di misurazioni triplicate di tre aliquote che mostrano l'AuNP sconosciuto. La portata trasversale costante applicata nel tempo di misurazione è illustrata come una linea nera. Il picco di vuoto a circa 5,9 minuti è evidenziato in grigio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Figura 4: Sovrapposizione della distribuzione media delle dimensioni delle particelle ottenuta (rosso) del campione AuNP sconosciuto e della funzione di calibrazione lineare applicata (linea tratteggiata). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Componente</td>
			<td>Cas-No</td>
			<td>Peso (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acqua</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acido 9-ottadecenoico (Z)-, composto con 2,2',2''-nitrilotris[etanolo](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Carbonato di sodio</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alcoli, C12-14-secondari, etossilati</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">EDTA tetrasodico</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polietilenglicole</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oleato di sodio</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bicarbonato di sodio</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1 : La commissione per i dati Elenco dei componenti della miscela di tensioattivi utilizzati per preparare l'eluente (vedere anche Tabella dei materiali).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parametri AF4-UV-vis</td>
			<td>Unità</td>
			<td>Valore</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spessore distanziale</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata del rivelatore</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata incrociata</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (costante per 8 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di messa a fuoco</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di ritardo /tempo di stabilizzazione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di iniezione</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di transizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di iniezione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase di eluizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Risciacquare il tempo di passaggio</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocità di flusso del passo di risciacquo</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume di iniezione</td>
			<td>Μl</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentrazione del campione</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo di membrana</td>
			<td></td>
			<td>Cellulosa rigenerata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taglio del peso molecolare della membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluente</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) miscela di tensioattivi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza d'onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilità UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2 : La commissione per i dati Riepilogo dei parametri del metodo di frazionamento AF4-UV-vis per eseguire l'iniezione diretta senza applicazione di una forza di separazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parametri AF4-UV-vis</td>
			<td>Unità</td>
			<td>Valore</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spessore distanziale</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata del rivelatore</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata incrociata</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (60 min costanti, 10 min lineari)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di messa a fuoco</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di ritardo /tempo di stabilizzazione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di iniezione</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di transizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di iniezione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase di eluizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>70 (60 min costanti, 10 min lineari)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passaggio di risciacquo</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocità di flusso del passo di risciacquo</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume di iniezione</td>
			<td>Μl</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentrazione del campione</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo di membrana</td>
			<td></td>
			<td>Cellulosa rigenerata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taglio del peso molecolare della membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluente</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) miscela di tensioattivi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza d'onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilità UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3 : La commissione per i dati Riepilogo dei parametri del metodo di frazionamento AF4-UV-vis per eseguire l'esecuzione del frazionamento con l'applicazione di un flusso incrociato come forza di separazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard di calibrazione</td>
			<td>Agente di tappatura</td>
			<td>Dimensione media (TEM) (nm)</td>
			<td>CV (dimensione media TEM) (%)</td>
			<td>Potenziale zeta (mV)</td>
			<td>SD (potenziale zeta) (mV)</td>
			<td>Raggio idrodinamico (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (Raggio idrodinamico) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4 : La commissione per i dati Riepilogo dei parametri fisico-chimici degli standard di calibrazione AuNP applicati, tra cui agente tappante, dimensione media TEM, potenziale Zeta determinato nella sospensione nativa così come raggio idrodinamico DLS e indice di polidispersità (PDI) determinato nell'eluente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard di calibrazione</td>
			<td>Correre</td>
			<td>Tempo di ritenzione al massimo massimo (min)</td>
			<td>Tempo di ritenzione netto al massimo massimo (min)</td>
			<td>Tempo medio di ritenzione netta (min)</td>
			<td>DS (%) (tempo di conservazione netto)</td>
			<td>SD (min) (tempo di ritenzione netto)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5 : La commissione per i dati Tempi di ritenzione degli standard di calibrazione AuNP al rispettivo picco UV-Vis massimo derivato dai rispettivi fractogrammi AF4-UV-vis utilizzando il metodo descritto nella tabella 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Correre</td>
			<td>Tempo di ritenzione massimo (min)</td>
			<td>Tempo medio di ritenzione al massimo massimo (min)</td>
			<td>Tempo di ritenzione netto al massimo massimo (min)</td>
			<td>DS (%) tempo di conservazione</td>
			<td>Raggio idrodinamico (nm)</td>
			<td>Recupero (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 6 : La commissione per i dati Riepilogo dei tempi di ritenzione al rispettivo picco UV-Vis massimo, del raggio idrodinamico calcolato dalla calibrazione delle dimensioni esterne (Figura 2) e del tasso di recupero del campione AuNP sconosciuto ottenuto dall'analisi AF4-UV-vis.

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Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Questo protocollo descrive l'uso del frazionamento campo-flusso di flusso asimmetrico accoppiato con il rilevamento UV-vis per la determinazione delle dimensioni di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto.

Frazionamento asimmetrico del flusso campo-flusso per il dimensionamento delle nanoparticelle d'oro in sospensione

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K Views.  Postnova Analytics GmbH. Questo protocollo descrive l'uso del frazionamento campo-flusso di flusso asimmetrico accoppiato con il rilevamento UV-vis per la determinazione delle dimensioni di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto.

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Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Le nanoparticelle fluorescenti per la misurazione della concentrazione di ioni in sistemi biologici

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Ricerca

Bioingegneria

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produzione di nanoparticelle metalliche mediante ablazione laser pulsata nei liquidi: uno strumento per studiare le proprietà antibatteriche delle nanoparticelle

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Proteina chinasi C-delta inibitore Peptide formulazione usando nanoparticelle d'oro

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...